本文關鍵詞：Ⅱ型抗CD20抗體誘導B細胞淋巴瘤死亡的作用機制研究

  更多相關文章： Ⅱ型抗CD20抗體 程序可控性壞死 TNFR 溶酶體依賴的細胞死亡

【摘要】：研究背景與研究目的非霍奇金淋巴瘤是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤,在世界范圍內(nèi)高發(fā)。每年新增病例約385000余例,死亡人數(shù)約199630。非霍奇金淋巴瘤在男女發(fā)病比例中分列第8位和第11位,占腫瘤年發(fā)病率的5.1%,腫瘤死亡率的2.7%。根據(jù)國際癌癥研究機構公布的GLOBOCAN2012年的數(shù)據(jù),該疾病是發(fā)達國家中死亡的首要原因,發(fā)展中國家第二重要的原因。2012年世界范圍內(nèi)約8.3萬人死亡。非霍奇金淋巴瘤在發(fā)達國家發(fā)病率較高,在發(fā)展中國家,惡性非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病率有逐年增高的趨勢,如泰國及中國。非霍奇金淋巴瘤中80%為B細胞表型,剩余為T細胞表型。CD20分子是細胞膜表面標志物,B細胞分化抗原。主要表達于前B細胞,成熟B細胞及多數(shù)惡性B淋巴細胞表面,而在造血干細胞、漿細胞和其他正常組織表面并不表達。CD20分子是治療B細胞淋巴瘤的理想靶標。因為CD20分子在細胞膜上比較暴露,且在B淋巴細胞表面表達水平較高,這使得利妥昔或者奧法木此類單克隆抗體比較容易接近并結合,同時,CD20分子與單克隆抗體結合后,沒有顯著的內(nèi)吞及脫落現(xiàn)象。這使得單克隆抗體可以長時間存在于細胞膜表面,長期提供由補體及FCR表達引起的持續(xù)性免疫攻擊,特別是來自巨噬細胞的免疫效應。CD20分子與單克隆抗體結合后也可以產(chǎn)生跨膜信號,雖然未經(jīng)證實,這可能提供抗CD20單克隆抗體的治療成功的重要原因。這些特點使抗CD20抗體被開發(fā)用于免疫治療,通過殺死正常或者惡性B細胞,在治療自身免疫性疾病和惡性腫瘤方面取得了顯著效果。以往的研究表明,抗CD20抗體可能涉及多種機制提供的治療效果,包括補體依賴細胞毒作用(CDC),抗體依賴性細胞毒性作用(ADCC)以及誘導細胞凋亡。這些引起抗腫瘤效應的不同的作用機制目前仍不明確,依然是問題的論點�；贑D20脂筏重新分配功能,抗CD20單克隆抗體可以簡單地分為兩類：Ⅰ型單克隆抗體(利妥昔單抗和大多數(shù)抗CD20抗體),此類單克隆抗體能夠有效地將CD20分子復合物轉(zhuǎn)脂筏介導CDC效應,但不能誘導細胞凋亡,Ⅱ型單克隆抗體(如B1),此類單克隆抗體不能促進CD20分子轉(zhuǎn)脂筏,也不能誘導CDC效應,而是更有效地誘導細胞凋亡。這兩種類型的單克隆抗體均可以介導ADCC效應及FCR段介導的粒細胞效應�？笴D20單克隆抗體在治療自身免疫疾病和惡性腫瘤中取得的成就使得單抗治療成為新的研究熱點。到目前為止,超過十種單克隆抗體已經(jīng)通過美國食品和藥物管理局(FDA)批準上市,Rituximab(美國IDEC生產(chǎn)C2B8)是以B細胞表面標志物CD20分子為靶點,第一個經(jīng)美國FDA批準用于治療復發(fā)或者難治性或者濾泡B細胞非霍奇金淋巴瘤的單克隆抗體。利妥昔單抗的成功鼓勵我們進一步改進現(xiàn)有的或者尋找新的抗CD20抗體。盡管利妥昔單抗治療B細胞淋巴瘤臨床效果比較顯著,仍有48%的病人對Rituximab的治療完全反應率低于10%。因此,為滿足臨床的提高藥效,增加單抗應用范圍的要求,尋求更為有效的抗CD20抗體治療顯得尤為迫切。在本文中,我們將著重討論抗CD20單克隆抗體的殺傷機制。這些單克隆抗體,尤其是通過對Ⅱ型抗CD20單克隆抗體抗腫瘤機制研究,驅(qū)動免疫治療,導致細胞死亡的研究機制討論其可能的作用方式,為以后抗體的進一步提高和開發(fā)提供思路。研究方法1)利用流式細胞儀技術(Flow cytometry),使用細胞死亡染料對細胞進行染色,體外鑒定細胞死亡,觀察不同抗體不同濃度情況下引起的細胞死亡狀況。并利用透射電鏡技術(TEM, Transmission electron microscope)觀察不同抗體處理后,細胞的死亡形態(tài),鑒定其死亡形式。2)借助western-blot,檢測細胞死亡通路的關鍵蛋白,確定或排除其誘導細胞死亡的信號通路。并通過熒光免疫共聚焦顯微鏡技術(Confocal immunofluorescence)觀察細胞各蛋白釋放情況,并通過其對應的抑制劑作用確定該蛋白與細胞死亡的相關性。3)運用免疫共沉淀(Co-IP)的方法,鑒定與CD20分子相關的蛋白,并運用銀染的方法分析CD20復合物中的蛋白,再利用western-blot的技術進行鑒定。同時利用其阻斷劑對其信號進行阻斷,觀察其作用,能否引起細胞死亡。并使用慢病毒干擾體系對細胞系進行體外干擾,使該蛋白低表達,使用流式細胞技術檢測其功能,驗證還能否引起細胞死亡。4)從下游通路向上反推,篩選起作用的抑制劑以確定上游信號通路。并運用熒光免疫共聚焦顯微鏡技術(Confocal immunofluorescence)檢測其蛋白釋放狀況,并通過抑制劑作用后再次驗證。實驗結果：1)Ⅱ型抗CD20抗體引起的細胞死亡并非凋亡,而是壞死：我們使用Ⅰ型抗CD20抗體Rituximab作為對照,Ⅱ型抗CD20抗體11B8以及此前研究中得到的突變型抗體HY102K為研究對象,發(fā)現(xiàn)Ⅱ型抗CD20抗體引起的細胞死亡并不是凋亡,而是一種壞死。且即使在交聯(lián)情況下,Ⅱ型抗CD20抗體誘導細胞死亡能力也明顯強于Ⅰ型抗CD20抗體,這種細胞死亡是濃度依賴的。2)這種細胞死亡是非Caspase依賴的,而是溶酶體依賴的細胞死亡：通過westen-blot的檢測,我們發(fā)現(xiàn)Ⅱ型抗CD20抗體引起的細胞死亡是一種非Caspase依賴的細胞死亡。通過熒光免疫共聚焦顯微鏡技術(Confocal immunofluorescence)檢測,我們發(fā)現(xiàn),這種細胞死亡是溶酶體依賴(lysosome-dependent)的細胞死亡。溶酶體破裂后釋放CathepsinB,這種細胞死亡可以被CathepsinB抑制劑所抑制。3)CD20分子與TNFR共同作用,激活下游通路：通過免疫共沉淀(Co-IP)的方法我們發(fā)現(xiàn)CD20相關復合物含有多種蛋白,應用銀染和westen-blot的方法,我們鑒定出TNFR與CD20分子天然結合,并共同激活信號通路,引起下游信號通路變化。我們初步認定這種細胞死亡是程序可控性壞死。運用其抑制劑necrosis可以顯著抑制細胞死亡。TNFR的阻斷劑同時也可以對抗體引起的細胞死亡有抑制作用。我們運用免疫共沉淀(Co-IP)發(fā)現(xiàn)了多種程序性壞死信號通路上的相關蛋白,并應用westen-blot技術觀察到了RIP1,RIP3的結合變化。認為只有Ⅱ型抗CD20抗體與CD20分子結合后可以激活程序性壞死(necroptosis)通路。運用慢病毒系統(tǒng)低表達RIP1后可以觀察到程序性壞死被抑制。4) Ceramide引起下游通路變化：已知細胞死亡是由溶酶體破裂,釋放CathepsinB后引起細胞死亡,通過大量抑制劑篩查,并通過流式檢測細胞死亡情況得知CE內(nèi)化后,FADS7激活sphingolipid-delta-4-desaturase(DES1),使D-erythro-sphinganie轉(zhuǎn)變?yōu)镈erythro-sphingosine(鞘氨醇),結合于蛋白酶C端,之后引起溶酶體破裂,釋放CathepsinB,最終誘導細胞死亡。并通過熒光免疫共聚焦顯微鏡技術進行了驗證。結論我們發(fā)現(xiàn)Ⅱ型抗CD20抗體引起的細胞死亡是一種程序可控型壞死而不是凋亡。這種細胞死亡為非Caspase依賴的,溶酶體依賴的細胞死亡。Ⅱ型抗CD20抗體與CD20分子結合后通過與TNFR協(xié)同作用引起下游信號通路變化,誘導細胞死亡。在下游通路上,我們得出的結果說明,神經(jīng)酰胺在Ⅱ型抗CD20抗體的刺激下內(nèi)化,FADS7泛素化降解激活sphingolipid-delta-4-desaturase,使D-erythro-sphinganie轉(zhuǎn)變?yōu)镈erythro-sphgosine,結合于組織蛋白酶特定的C區(qū)并激活,之后引起溶酶體破裂,釋放CathepsinB,最終誘導細胞死亡。本文詳細說明了Ⅱ型抗CD20抗體殺傷腫瘤細胞的作用機制,并首次提出了CD20與TNFR共同傳導信號的模型,為臨床應用Ⅱ型抗CD20抗體治療淋巴瘤提供了理論依據(jù),解釋了其信號傳導通路。希望能為今后設計更好的治療淋巴瘤的抗體藥物和設計更合適的聯(lián)合用藥方法提供思路。
【關鍵詞】：Ⅱ型抗CD20抗體 程序可控性壞死 TNFR 溶酶體依賴的細胞死亡
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.1
【目錄】：

• 摘要6-10
• Abstract10-14
• 縮略詞表14-16
• 前言16-19
• 第一部分 Ⅱ型抗CD20抗體誘導細胞死亡19-32
• 一、實驗材料19-21
• 二、實驗方法21-26
• 三、實驗結果26-30
• 四、討論30-32
• 第二部分 Ⅱ型抗體誘導Caspase非依賴的壞死32-57
• 一、實驗材料33-37
• 二、實驗方法37-46
• 三、實驗結果46-54
• 四、討論54-57
• 第三部分 CD20與TNFR的協(xié)同作用57-69
• 一、實驗材料58-59
• 二、實驗方法59-61
• 三、實驗結果61-66
• 四、討論66-69
• 第四部分 Ceramide在細胞死亡中的重要作用69-78
• 一、實驗材料70-71
• 二、實驗方法71-72
• 三、實驗結果72-76
• 四、討論76-78
• 參考文獻78-85
• 全文小結85-86
• 綜述 受體相關蛋白酶（RIP)在細胞存亡中的作用86-94
• 參考文獻92-94
• 綜述 抗CD20抗體治療淋巴瘤治療進展94-109
• 參考文獻100-109
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明109-110
• 致謝110

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊智;龍庭鳳;沈劍;何黎;;皮膚B細胞淋巴瘤[J];臨床皮膚科雜志;2006年11期

2 徐靈;白樹明;徐慧;;原發(fā)性肺黏膜相關淋巴組織B細胞淋巴瘤臨床病理分析[J];中國傷殘醫(yī)學;2009年04期

3 孫淼淼;馬怡暉;董雷剛;吳晶晶;陳奎生;張明智;;原發(fā)性肺黏膜相關淋巴組織B細胞淋巴瘤臨床病理分析[J];腫瘤防治研究;2013年04期

4 崔振英;周博;鄧澤海;周詩侗;張銀;后群;;喉B細胞淋巴瘤合并同側甲狀腺微小乳頭狀癌1例[J];臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2013年21期

5 Iwano M.,Okazaki K. ,Uchida K. ,趙麗娜;涉及多器官的黏膜相關淋巴組織型胃的B細胞淋巴瘤的特性[J];世界核心醫(yī)學期刊文摘(胃腸病學分冊);2005年02期

6 M.S Kaminski,K.Kitamura,D.G.Maloney,M.J.Campbell,R.Levy,張明杰;用抗獨特型單克隆抗體治療具有同型轉(zhuǎn)換變異抗體的小鼠B細胞淋巴瘤[J];細胞與分子免疫學雜志;1987年04期

7 劉學政;侯瑞鵬;張鵬;;維生素C對光照后兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞內(nèi)B細胞淋巴瘤表達的影響[J];眼視光學雜志;2006年06期

8 陳一天;陳龍邦;;血管內(nèi)大B細胞淋巴瘤的診療進展[J];醫(yī)學研究生學報;2008年02期

9 楊雪峰;穆青清;王麥建;黃韓冬;黃瓊;程家平;;原發(fā)性闌尾黏膜相關性B細胞淋巴瘤誤診1例[J];重慶醫(yī)學;2011年34期

10 魏小娟;李文瑜;;血管內(nèi)大B細胞淋巴瘤的診治[J];循證醫(yī)學;2012年05期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 高子芬;;B細胞淋巴瘤病理診斷和鑒別診斷[A];第十一屆中國抗癌協(xié)會全國淋巴瘤學術大會教育論文集[C];2009年

2 李艷瑩;王艷芳;克曉燕;;組蛋白去乙�；敢种苿┪鬟_苯胺對B細胞淋巴瘤的凋亡作用及其機制研究[A];第13屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2011年

3 章衛(wèi)平;王健民;陳莉;宋獻民;侯軍;高磊;邱慧穎;王利平;楊丹;周虹;李紅梅;;利妥昔單抗聯(lián)合自體外周血干細胞移植治療B細胞淋巴瘤[A];第12屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2009年

4 房輝;李曄雄;;原發(fā)縱隔B細胞淋巴瘤療效分析[A];2007第六屆全國放射腫瘤學學術年會論文集[C];2007年

5 章衛(wèi)平;王健民;陳莉;宋獻民;王利平;楊丹;周虹;李紅梅;;利妥昔單抗聯(lián)合自體外周血干細胞移植治療B細胞淋巴瘤[A];第十一屆中國抗癌協(xié)會全國淋巴瘤學術大會教育論文集[C];2009年

6 朱軍;張運濤;鄭文;王小沛;勇威本;李囡;林保和;許小寶;;~(131)I-美羅華顯像在B細胞淋巴瘤中的初步臨床應用研究[A];中華醫(yī)學會第八次全國血液學學術會議論文匯編[C];2004年

7 劉紅;江渝;孔佩艷;陳幸華;劉林;張曦;王慶余;;美羅華聯(lián)合FMD方案治療難治性B細胞淋巴瘤的療效[A];第10屆全國實驗血液學會議論文摘要匯編[C];2005年

8 何鳳貞;劉淑英;;美羅華治療B細胞淋巴瘤不良反應的預防和觀察護理[A];2009年浙江省血液病學學術年會論文集[C];2009年

9 劉艷輝;莊恒國;林漢良;吳秋良;羅東蘭;駱新蘭;;富于T細胞/組織細胞的B細胞淋巴瘤組織學、免疫表型及鑒別診斷[A];中華醫(yī)學會病理學分會2005年學術年會論文匯編[C];2005年

10 林朝春;吳艷云;王丁蘭;;美羅華治療B細胞淋巴瘤的護理體會[A];全國腫瘤護理學術交流暨專題講座會議論文匯編[C];2003年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 陳雅琳;Ⅱ型抗CD20抗體誘導B細胞淋巴瘤死亡的作用機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2015年

2 王楠婭;腺相關病毒載體介導的MDA7/IL-24基因治療小鼠B細胞淋巴瘤的療效與機制研究[D];吉林大學;2011年

3 徐利明;原發(fā)縱隔B細胞淋巴瘤綜合治療及調(diào)強放療結果和劑量分析[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2013年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 梁云;染色體的易位、重排與B細胞淋巴瘤發(fā)病關系的初步研究[D];浙江大學;2006年

2 劉北辰;MLL2在B細胞淋巴瘤中的表達及調(diào)控機制研究[D];河北醫(yī)科大學;2014年

3 范林妮;脾臟微結節(jié)性富于T細胞/組織細胞的B細胞淋巴瘤—免疫表型及基因重排研究[D];第四軍醫(yī)大學;2009年

4 劉小蘭;CIK細胞與DC共培養(yǎng)抗B細胞淋巴瘤作用研究[D];山西醫(yī)科大學;2013年

5 葛立業(yè);組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶NSD2、EZH2在B細胞淋巴瘤中的表達[D];大理學院;2013年

6 周軍;胃腸道侵襲性B細胞淋巴瘤的臨床病理學研究[D];南京大學;2013年

，

本文編號：1109117