發(fā)布時(shí)間：2017-10-23 23:22

  本文關(guān)鍵詞：胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露模型的建立及相關(guān)神經(jīng)毒性研究

  更多相關(guān)文章： 丙泊酚 斑馬魚(yú)胚胎 細(xì)胞凋亡 Myelin basic protein Synapsin Ⅱa

【摘要】：研究背景近10年來(lái),臨床回顧性分析研究已經(jīng)證實(shí),新生兒及嬰幼兒早期接受全身麻醉和鎮(zhèn)靜,可引起隨后的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙,包括學(xué)習(xí)能力下降、認(rèn)知功能減弱等。這一結(jié)果,不僅引起醫(yī)療專家的關(guān)注,也引起了管理者和患兒家長(zhǎng)的廣泛重視。尤其,隨著孕期婦女非產(chǎn)科手術(shù)比例的增加(0.15%-2%),全身麻醉是否會(huì)影響胎兒神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育,導(dǎo)致出生后的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙,成為臨床麻醉關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。靜脈麻醉藥物丙泊酚(又名異丙酚,英文名稱Propofol,化學(xué)名2,6-二異丙基苯酚)因起效迅速、代謝快而完全、蘇醒快而平穩(wěn)、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于各類手術(shù)的全麻誘導(dǎo)和維持中,尤其適用于嬰幼兒手術(shù)麻醉、氣管插管、內(nèi)鏡檢查等操作和ICU的鎮(zhèn)靜。然而,與其他麻醉藥物的神經(jīng)毒性作用相似,研究發(fā)現(xiàn),早期接觸丙泊酚也可引起發(fā)育中大腦廣泛的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致長(zhǎng)期的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙,如學(xué)習(xí)、認(rèn)知能力下降。進(jìn)一步研究還證實(shí),丙泊酚可影響突觸的形成過(guò)程,通過(guò)影響樹(shù)突棘的形態(tài)和濃度,突觸結(jié)構(gòu)的數(shù)量來(lái)改變神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo),最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育畸形,出現(xiàn)行為的異常。突觸的形成是由多種基因、蛋白質(zhì)參與的復(fù)雜的生理過(guò)程。其中mbp和synapsin Ha (syn2a)基因在突觸的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Abp基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯,編碼形成鞘磷脂蛋白(Myelin basic protein, Mbp)。Mbp是少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)的一種蛋白,其圍繞神經(jīng)元的軸突形成髓鞘,是保證神經(jīng)信號(hào)快速、單向傳導(dǎo)的重要結(jié)構(gòu)。如果Mbp蛋白表達(dá)異常,導(dǎo)致髓鞘的形成受到損害、減少甚至缺失,不僅會(huì)影響神經(jīng)信號(hào)的傳遞,也會(huì)導(dǎo)致硬化相關(guān)性疾病的發(fā)生,主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能的障礙、語(yǔ)言、視力減弱、震顫、肌痙攣等。Syn2a基因是調(diào)節(jié)突觸結(jié)構(gòu)形成的基因,其表達(dá)的異常會(huì)直接影響突觸結(jié)構(gòu)的形態(tài)及數(shù)量。然而,目前關(guān)于丙泊酚對(duì)mbp和syn2a基因及蛋白表達(dá)影響的研究較少,尤其是胚胎期丙泊酚暴露,是否會(huì)通過(guò)影響mbp、syn2a基因和蛋白的表達(dá)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙?為解決這一疑問(wèn),需要更多的研究探討丙泊酚暴露對(duì)mbp和syn2a基因及蛋白表達(dá)的影響及相關(guān)的分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),丙泊酚的神經(jīng)毒性作用具有時(shí)間依賴性,即在突觸發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期(相當(dāng)于嚙齒類動(dòng)物出生后7-14天左右)最為敏感。因此,目前相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均選取出生后7-15天的幼鼠。那么,對(duì)于神經(jīng)發(fā)育的起始階段-胚胎期,神經(jīng)干細(xì)胞向各級(jí)神經(jīng)元分化、遷移、增殖的重要時(shí)期,是否對(duì)丙泊酚更加敏感?在此期間接受丙泊酚暴露是否會(huì)影響胚胎發(fā)育?是否會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡甚至影響mbp和syn2a基因及蛋白的表達(dá)呢?探討這一系列問(wèn)題具有重要的研究?jī)r(jià)值和意義。這不僅是丙泊酚神經(jīng)毒性研究在作用時(shí)間上的擴(kuò)展,更是機(jī)制研究的深入。由于哺乳動(dòng)物胚胎宮內(nèi)發(fā)育的特點(diǎn),目前較少有丙泊酚對(duì)活體胚胎期生物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育影響的文獻(xiàn)報(bào)道,因此,需要建立新的動(dòng)物模型,探討胚胎期丙泊酚暴露的神經(jīng)毒性作用。斑馬魚(yú)的出現(xiàn),解決了哺乳類動(dòng)物無(wú)法解決的問(wèn)題。斑馬魚(yú)做為一種新型模式動(dòng)物,因其胚胎體外受精、體外發(fā)育,且胚胎透明、易于觀察與操作等特點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)損傷和神經(jīng)行為學(xué)等神經(jīng)科學(xué)研究。尤其斑馬魚(yú)胚胎透明,易于觀察與操作等優(yōu)勢(shì),已成為篩查藥物胚胎期神經(jīng)毒性的首選模式動(dòng)物。通過(guò)免疫熒光、熒光探針、活體成像等技術(shù)可直接觀察活體動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞或蛋白表達(dá)的變化。更值得一提的是,斑馬魚(yú)因繁殖周期短,生產(chǎn)量等優(yōu)勢(shì),不僅降低了構(gòu)建轉(zhuǎn)基因魚(yú)的技術(shù)難度,還大大縮短了時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。因此,憑借斑馬魚(yú)模式動(dòng)物的諸多優(yōu)勢(shì),本研究通過(guò)建立胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露模型,探討胚胎期丙泊酚暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的神經(jīng)毒性作用,包括對(duì)胚胎發(fā)育生存率、孵化率和畸形率的影響；對(duì)胚胎細(xì)胞凋亡的影響及對(duì)mbp和syn2a基因及蛋白表達(dá)的影響。研究成果,不僅能為基礎(chǔ)研究提供新的理論依據(jù),更重要的是可為臨床應(yīng)用提供重要參考,為如何安全有效的開(kāi)展孕婦及新生兒、嬰幼兒麻醉工作,提供科學(xué)依據(jù)。研究目的1.建立胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露模型；2.探討胚胎期丙泊酚暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中生存率、孵化率和畸形率的影響及對(duì)7dpf幼魚(yú)腦組織結(jié)構(gòu)的影響；3.探討胚胎期丙泊酚暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎及幼魚(yú)細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)的分子制：4.探討胚胎期丙泊酚暴露對(duì)斑馬魚(yú)mbp和syn2a基因及蛋白表達(dá)的響。研究?jī)?nèi)容與方法1.建立胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露模型目前,尚無(wú)采用斑馬魚(yú)研究丙泊酚神經(jīng)毒性作用的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,因此,本研究的第一部分內(nèi)容是建立斑馬魚(yú)胚胎丙泊酚暴露模型。以受精后的斑馬魚(yú)胚胎和幼魚(yú)為研究對(duì)象,通過(guò)檢測(cè)不同時(shí)間和不同濃度丙泊酚暴露下,胚胎發(fā)育孵化率、畸形率和生存率的變化來(lái)確定合理的暴露濃度和時(shí)間。具體內(nèi)容如下：1)為確定斑馬魚(yú)胚胎丙泊酚暴露濃度和暴露時(shí)間,將受精后6-48小時(shí)(6-48hpf,hours post-fertilization)的胚胎浸泡于含不同濃度丙泊酚(1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、9μg/ml)和含相同劑量DMSO(丙泊酚溶劑,0.013%)及空白對(duì)照幼魚(yú)孵化水中。24hpf時(shí)將各組受試液均更新一半(含丙泊酚和DMSO溶液),48hpf全部更換為孵化水。2)為檢測(cè)胚胎期丙泊酚暴露的一般毒性作用,分別在24、48、72、96和120hpf時(shí),記錄各實(shí)驗(yàn)組胚胎生存率、孵化率、畸形率以及畸形特征。3)為檢測(cè)胚胎期丙泊酚暴露對(duì)腦部發(fā)育的影響,取暴露后7dpf (days post-fertilization)幼魚(yú),通過(guò)HE染色檢測(cè)其腦部細(xì)胞數(shù)量和腦室腔的變化。4)為檢測(cè)丙泊酚的麻醉效果,取健康6dpf幼魚(yú)分別浸泡于含不同濃度丙泊酚(1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml)、含相同劑量DMSO(0.013%)及空白對(duì)照養(yǎng)魚(yú)水中,浸泡30min后全部更換為新鮮養(yǎng)魚(yú)水,觀察24h。通過(guò)記錄各組幼魚(yú)麻醉起效時(shí)間、復(fù)蘇時(shí)間及死亡率來(lái)評(píng)價(jià)丙泊酚的麻醉效應(yīng)。2.檢測(cè)胚胎期丙泊酚暴露的神經(jīng)毒性作用哺乳類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí),出生后早期丙泊酚暴露可以引起發(fā)育中大腦廣泛的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。因此,胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露模型建立成功后,第二部分研究?jī)?nèi)容就是檢測(cè)胚胎期丙泊酚暴露對(duì)細(xì)胞凋亡的影響及可能的分子機(jī)制。同時(shí),進(jìn)一步探討了胚胎期丙泊酚暴露對(duì)mbp和syn2a基因及蛋白表達(dá)的影響。具體內(nèi)容如下：1)為檢測(cè)胚胎期丙泊酚暴露的促細(xì)胞凋亡作用,取暴露后36hpf胚胎,通過(guò)整體吖啶橙染色,比較各組胚胎整體凋亡細(xì)胞數(shù)量的變化。2)為檢測(cè)丙泊酚促細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制,取暴露后36hpf胚胎,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)基因caspase-3、caspase-8和caspase-9 mRNA表達(dá)的變化。3)為檢測(cè)丙泊酚對(duì)孵化后幼魚(yú)的神經(jīng)毒性作用,取經(jīng)暴露后3dpf幼魚(yú),通過(guò)整體吖啶橙染色,比較各組幼魚(yú)腦部凋亡細(xì)胞的變化。4)為檢測(cè)丙泊酚對(duì)孵化后幼魚(yú)的神經(jīng)毒性作用,取經(jīng)暴露后3dpf幼魚(yú),通過(guò)qRT-PCR、整體原位雜交技術(shù)和western blots法,分析mbp和syn2a基因及蛋白表達(dá)的變化。研究結(jié)果1.1、2、3μg/ml丙泊酚是研究胚胎期丙泊酚神經(jīng)毒性作用的最佳濃度將6-48hpf斑馬魚(yú)胚胎浸泡于含不同濃度丙泊酚、DMSO和空白對(duì)照幼魚(yú)孵化水中發(fā)現(xiàn),在1、2、3μg/ml丙泊酚暴露組,從24hpf至120hpf,胚胎發(fā)育的生存率均高于93%,與空白對(duì)照組和DMSO組比較,無(wú)顯著性差異。DMSO組與空白對(duì)照組比較,各時(shí)間點(diǎn)生存率也無(wú)顯著差異。然而,在4、6、9μg/ml丙泊酚暴露組,胚胎及幼魚(yú)的生存率顯著下降(P0.05),且分別在96hpf (6μg/ml丙泊酚組)和48hpf (9μg/ml丙泊酚組)全部死亡。比較各實(shí)驗(yàn)組胚胎孵化率發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組和DMSO組比較,1、2、3μg/ml丙泊酚暴露組的胚胎孵化率在48hpf (P0.05)和72hpf (P0.05)均顯著降低；DMSO組與空白對(duì)照組相比,無(wú)顯著性差異(P0.05)。比較各實(shí)驗(yàn)組5dpf幼魚(yú)畸形率也發(fā)現(xiàn),丙泊酚暴露組畸形率顯著增高(P0.05)；DMSO組與空白對(duì)照組相比,無(wú)顯著差異(P0.05)。幼魚(yú)的畸形主要表現(xiàn)為：心包囊腫、脊柱彎曲、眼睛變小和出血等。以上結(jié)果顯示,胚胎期1、2、3μg/ml丙泊酚暴露對(duì)胚胎發(fā)育具有毒性作用,表現(xiàn)為延緩胚胎孵化率,增加胚胎發(fā)育的畸形率。但在此濃度暴露下的斑馬魚(yú)從胚胎到幼魚(yú),生存率均無(wú)顯著變化,提示1、2、3μg/ml丙泊酚是探討胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露神經(jīng)毒性作用的最佳濃度。2.1、2、3μg/ml丙泊酚具有麻醉效果由于斑馬魚(yú)體積較小,無(wú)法精確測(cè)量經(jīng)浸泡后幼魚(yú)體內(nèi)丙泊酚的血藥濃度。為檢測(cè)該濃度下丙泊酚的麻醉效應(yīng),將6dpf幼魚(yú)浸泡于含不同濃度丙泊酚、DMSO及空白對(duì)照養(yǎng)魚(yú)水中30min。對(duì)針尖觸碰魚(yú)尾無(wú)反應(yīng),且無(wú)自主運(yùn)動(dòng)能力的幼魚(yú)被認(rèn)為進(jìn)入麻醉狀態(tài)。結(jié)果顯示,在1、2、3μg/ml丙泊酚組,各組幼魚(yú)均在90s內(nèi)進(jìn)入麻醉狀態(tài),平均時(shí)間(s)分別為60(45,75)、45(30,60)、30(30,45),空白對(duì)照組和DMSO組幼魚(yú)均可自由游動(dòng)。麻醉30min后,各組幼魚(yú)復(fù)蘇時(shí)間從60min-150min不等,平均時(shí)間(min)分別為75(75,90)、120(105,120)、120(120,135)。麻醉及復(fù)蘇后24h內(nèi),無(wú)幼魚(yú)死亡。綜上所述,1、2、3μg/ml丙泊酚是研究胚胎期丙泊酚暴露神經(jīng)毒性作用的最佳濃度,不僅對(duì)胚胎發(fā)育具有一定毒性作用,而且對(duì)幼魚(yú)具有臨床麻醉效應(yīng),符合研究藥物毒性作用的實(shí)驗(yàn)要求。3.丙泊酚可影響7dp坳魚(yú)腦組織結(jié)構(gòu)比較經(jīng)胚胎期1、2、3μg/ml丙泊酚暴露,發(fā)育至7dpf幼魚(yú)的腦部組織結(jié)構(gòu)可見(jiàn),與對(duì)照組相比,丙泊酚處理組幼魚(yú)腦組織結(jié)構(gòu)腔隙增大,細(xì)胞數(shù)量減少。提示,胚胎期丙泊酚暴露對(duì)斑馬魚(yú)腦部發(fā)育具有毒性作用。4.丙泊酚可誘導(dǎo)36hpf胚胎細(xì)胞凋亡增加,上調(diào)‘caspase-3、-8和-9mRNA表達(dá)研究已經(jīng)證實(shí),丙泊酚可引起發(fā)育中大腦廣泛的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,那么對(duì)于斑馬魚(yú)是否具有相同的作用呢?本研究顯示：在對(duì)照組中,36hpf胚胎整體未見(jiàn)明顯的凋亡細(xì)胞信號(hào)；在1、2、3μg/ml丙泊酚組,在胚胎頭部、尾部均可見(jiàn)凋亡細(xì)胞,數(shù)量明顯增多。Caspase家族參與的信號(hào)傳導(dǎo)通路是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序的重要機(jī)制之一,其中caspase-3、caspase-8和caspase-9在此過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,丙泊酚暴露組胚胎體內(nèi)caspase-3、-8、-PmRNA表達(dá)均顯著增高(P0.05)。進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn),caspase-8和caspase-9在三個(gè)劑量丙泊酚暴露組的表達(dá)呈劑量依賴性上調(diào)(P0.05)。以上結(jié)果提示,胚胎期丙泊酚暴露引起的促細(xì)胞凋亡作用可能與caspase信號(hào)通路的激活有關(guān),且丙泊酚的神經(jīng)毒性作用隨著藥物濃度的增高而增強(qiáng)。5.丙泊酚可誘導(dǎo)3dpf幼魚(yú)腦部細(xì)胞凋亡增多3dpf是斑馬魚(yú)胚胎孵化為幼魚(yú)的關(guān)鍵時(shí)期,為檢測(cè)丙泊酚促細(xì)胞凋亡作用的持續(xù)性,本研究分析了3dpf幼魚(yú)腦組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量的變化。結(jié)果顯示,與對(duì)照相比,丙泊酚暴露組腦部凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著增多(P0.05)。并且,3μg/ml丙泊酚暴露組腦部凋亡細(xì)胞數(shù)量高于1μg/m1丙泊酚暴露組(P0.05)。提示丙泊酚的促細(xì)胞凋亡作用具有持續(xù)性,且隨著藥物濃度的增高而增強(qiáng)。6.丙泊酚可下調(diào)mbp mRNA及蛋白的表達(dá)Mbp和syn2a基因是突觸形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用的兩種基因。然而,目前很少有研究探討丙泊酚對(duì)此兩種基因表達(dá)的影響。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)胚胎期1、2、3μg/ml丙泊酚暴露后,各組3dp坳魚(yú)mbp mRNA表達(dá)顯著下降(P0.05)。通過(guò)整體原位雜交法發(fā)現(xiàn),mbp mRNA下調(diào)程度可分為三個(gè)級(jí)別：無(wú)變化、輕度下降和嚴(yán)重下降。整體原位雜交結(jié)果還顯示,mbp mRNA表達(dá)的下降主要表現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng),外周神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)無(wú)顯著差異。Mbp蛋白檢測(cè)也顯示一致結(jié)果,與對(duì)照組相比,丙泊酚暴露組幼魚(yú)Mbp蛋白的表達(dá)呈劑量依賴性下降(P0.05)。然而,分析發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,丙泊酚暴露組幼魚(yú)syn2a基因mRNA的表達(dá)無(wú)顯著差異(P0.05)。結(jié)論1.將6-48hpf斑馬魚(yú)胚胎通過(guò)浸泡方式暴露于含1、2、3μg/ml丙泊酚幼魚(yú)孵化水中,是研究胚胎期丙泊酚暴露神經(jīng)毒性作用的最佳動(dòng)物模型；2.胚胎期丙泊酚暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育具有毒性作用,表現(xiàn)為：延遲胚胎孵化的時(shí)間,引起胚胎發(fā)育的畸形及影響腦組織結(jié)構(gòu)的正常發(fā)育；3.胚胎期丙泊酚暴露可引起胚胎整體細(xì)胞凋亡增多,且細(xì)胞凋亡的發(fā)生可能與caspase-3、-8、-9參與的信號(hào)通路的激活有關(guān)。4.胚胎期丙泊酚暴露的神經(jīng)毒性作用具有持久性,在暴露后24h,丙泊酚仍可誘導(dǎo)幼魚(yú)腦部細(xì)胞凋亡增加,且明顯抑制mbp基因mRNA和蛋白的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：丙泊酚 斑馬魚(yú)胚胎 細(xì)胞凋亡 Myelin basic protein Synapsin Ⅱa
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R-332;R714.5
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 前言19-30
• 第一章 胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露模型的建立30-47
• 引言30
• 1 材料與方法30-35
• 2 統(tǒng)計(jì)分析35-36
• 3 結(jié)果36-43
• 4 討論43-47
• 第二章 胚胎期丙泊酚暴露對(duì)斑馬魚(yú)神經(jīng)毒性作用研究47-79
• 引言47
• 1 材料與方法47-65
• 2 統(tǒng)計(jì)分析65
• 3 結(jié)果65-72
• 4 討論72-79
• 全文總結(jié)79-82
• 參考文獻(xiàn)82-95
• 綜述95-110
• 參考文獻(xiàn)103-110
• 中英文縮寫(xiě)對(duì)照表110-111
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文111-112
• 致謝112-114
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明114

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本文編號(hào)：1085905