本文關(guān)鍵詞：EphB信號在軸向仿生壓應(yīng)力調(diào)控MSC成骨分化中的作用和機制研究

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【摘要】：研究背景臨床實踐和實驗室研究表明,不同強度的壓應(yīng)力對骨的生理、病理活動產(chǎn)生不同的影響,但遠未能闡明其機制。因此,深入研究壓應(yīng)力調(diào)控骨組織生理、病理活動的分子機制,尋找壓應(yīng)力促進或抑制成骨的轉(zhuǎn)化條件,對臨床上正確運用壓應(yīng)力具有重要的指導意義,并有望為探索骨傷病的療法提供新思路。由于體內(nèi)力學環(huán)境和生化環(huán)境過于復(fù)雜,難以得出可重復(fù)的結(jié)果,該領(lǐng)域的研究多采用體外應(yīng)力環(huán)境。目前的商品化或自制的生物反應(yīng)器普遍不能提供精確的仿生應(yīng)力環(huán)境,也難以提供長期穩(wěn)定的培養(yǎng)基生化環(huán)境,成為該研究領(lǐng)域的技術(shù)瓶頸。肝配蛋白ephrin及其受體Eph(ephrin receptor)家族近年來被發(fā)現(xiàn)參與了骨骼發(fā)育、重塑和骨相關(guān)疾病的調(diào)控,可能成為我們深入認識應(yīng)力調(diào)控骨生理、病理活動機制的新線索。本研究采用反饋調(diào)節(jié)的設(shè)計思路,制作了一款可以為粘彈性生物材料和組織提供精確拉伸應(yīng)力和壓應(yīng)力的新型生物反應(yīng)器,以此為基礎(chǔ)研究了體外三維仿生培養(yǎng)環(huán)境中間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)成骨分化的調(diào)控因素,以及Eph B4、B6參與力學-化學信號轉(zhuǎn)化并調(diào)控MSC成骨分化的機制。方法1、本研究著重改進生物反應(yīng)器的施力功能,在施力裝置中整合柔性元件,用于施力器和組織之間的拉、壓應(yīng)力傳遞,消除剛性接觸導致的應(yīng)力突變、瞬態(tài)過沖。根據(jù)脛骨平臺下松質(zhì)骨與跟腱的受力模型編寫仿生應(yīng)力控制軟件,為新型施力裝置提供反饋控制環(huán)路。改進培養(yǎng)基生化環(huán)境控制系統(tǒng),包括中空纖維半透膜重新選材,優(yōu)化了物質(zhì)交換器內(nèi)部液流途徑,優(yōu)化pH、PO2、PCO2的控制程序。2、將組織工程骨分為靜置培養(yǎng)、單純應(yīng)力培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)三組,以檢測生物反應(yīng)器的仿生應(yīng)力環(huán)境和生化環(huán)境對三維培養(yǎng)細胞的影響。3、用PCR檢測MSC成骨分化后的ephrin、Eph家族表達變化,確定EphB6為主要研究對象后,通過配體激活、siRNA、過表達研究其對MSC成骨分化的調(diào)控作用。為了解Eph B6的下游信號,檢測Rho A磷酸化水平,并用ROCK抑制劑阻斷rhoa-rock通路。4、在生物反應(yīng)器工作參數(shù)中明確定義適度壓應(yīng)力、過度壓應(yīng)力,用免疫共沉淀、激光共聚焦研究ephb4、ephb6與整合素β亞基是否發(fā)生聯(lián)系,用免疫共沉淀檢測ephb與整合素β亞基是否與其他蛋白形成復(fù)合體。用生物信息學技術(shù)預(yù)測ephb與整合素β亞基是否有直接接觸及可能的結(jié)合位點。結(jié)果1、在施力裝置中整合柔性元件,實現(xiàn)對具有粘彈性的組織和生物材料均勻、穩(wěn)定施力。通過有限元技術(shù)獲得人體組織承受生物應(yīng)力的仿生模型,并以此為依據(jù)編寫了仿生應(yīng)力控制軟件。同時改進物質(zhì)交換系統(tǒng),使培養(yǎng)基的生化指標在預(yù)設(shè)的范圍內(nèi)長期保持穩(wěn)定。2、改進后的生物反應(yīng)器能促進組織工程骨中的msc增殖和成骨分化。在仿生壓應(yīng)力的作用下,三維支架里的細胞排列有序,細胞骨架伸展方向一致,表明該生物反應(yīng)器能夠為組織工程骨提供三維應(yīng)力環(huán)境,為后繼實驗奠定了基礎(chǔ)。3、定量pcr和免疫熒光染色表明ephb6在msc成骨分化時表達下調(diào)。ephb6與配體ephrinb1結(jié)合后使alp活性和runx2表達降低。sirna沉默ephb6使msc的runx2表達上調(diào),alp活性增高,鈣結(jié)節(jié)染色增強,而過表達ephb6則出現(xiàn)相反的結(jié)果。但上述基因操作均不會影響msc的成軟骨分化和成脂肪分化。4、rhoa的磷酸化水平與成骨分化呈負相關(guān),受到ephb6sirna干擾的細胞在成骨誘導培養(yǎng)第7天有更多gtp-rhoa,而過表達的細胞則顯著減少。在msc成骨誘導培養(yǎng)基中添加rock抑制劑y-27632,發(fā)現(xiàn)runx2的表達上調(diào),在sirna干擾和過表達ephb6的細胞中也同樣檢測到runx2的表達上調(diào)。5、本研究在自制的生物反應(yīng)器上將0.5hz、峰值10%形變的仿生壓應(yīng)力定義為適度壓應(yīng)力,0.5hz、峰值20%形變的仿生壓應(yīng)力將過度壓應(yīng)力,并證實適度壓應(yīng)力下組織工程骨的alp活性和runx2表達增強,能促進msc成骨分化,而過度壓應(yīng)力則會抑制msc成骨分化。由此為后續(xù)研究確立了力學標準。6、在適度壓應(yīng)力下,ephb4與整合素β1形成免疫共沉淀,過度壓應(yīng)力下ephb6與整合素β3形成免疫共沉淀。激光共聚焦觀察到,適度壓應(yīng)力下ephb4與整合素β1共同分布在細胞膜的部分區(qū)域,并且被募集到f-actin的起始端。而ephb6則在過度壓應(yīng)力下與整合素β3共同分布在細胞膜上,且募集到f-actin的起始端。7、fak、vinculin和paxilin在適度壓應(yīng)力和過度壓應(yīng)力下均與ephb4形成了免疫共沉淀,但不與ephb6發(fā)生聯(lián)系。8、生物信息學分析預(yù)測EphB與整合素β亞基可能有直接聯(lián)系。Eph B6可能的結(jié)合位點序列是230-290、362-393、555-580、610-635,整合素β3可能的結(jié)合位點序列是189-204、284-313。結(jié)論1、該新型生物反應(yīng)器配合仿生應(yīng)力控制軟件和物質(zhì)交換系統(tǒng),能夠為組織和三維生物材料提供精確仿生的應(yīng)力培養(yǎng)環(huán)境。2、Eph B6抑制MSC成骨分化,可能是通過提高Rho A磷酸化水平來發(fā)揮作用的。沉默表達或過表達Eph B6基因操作均不會影響MSC的成軟骨分化和成脂肪分化,可見EphB6是特異性地抑制MSC的成骨分化能力,而不是弱化其分化潛能。3、本研究在自制的生物反應(yīng)器上定義了適度壓應(yīng)力和過度壓應(yīng)力,為后續(xù)研究確立了力學標準。發(fā)現(xiàn)在不同強度壓應(yīng)力下Eph B4、B6分別與整合素β1、β3發(fā)生聯(lián)系,且EphB4、B6被募集到F-actin的起始端。由此推測,在應(yīng)力環(huán)境下,整合素與F-actin(即細胞骨架)結(jié)合后,能直接接觸或間接與Eph B分子形成復(fù)合體,再通過EphB向細胞內(nèi)傳遞信號,實現(xiàn)力學-化學信號轉(zhuǎn)化4、FAK、Vinculin和Paxilin參與了EphB4-整合素β1形成的復(fù)合體,可能具有放大信號或啟動多個信號通路的作用。5、生物信息學分析預(yù)測Eph B與整合素β亞基可能有直接聯(lián)系,其結(jié)合位點之一位于EphB的胞外FNⅢ重復(fù)序列。
【關(guān)鍵詞】：仿生壓應(yīng)力 肝配蛋白 間充質(zhì)干細胞 成骨分化 整合素 生物反應(yīng)器 力學信號傳導
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R68
【目錄】：

• 縮略詞表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 改進組織工程生物反應(yīng)器并建立三維軸向仿生應(yīng)力環(huán)境14-40
• 2.1 材料與方法16-25
• 2.2 結(jié)果25-36
• 2.3 討論36-39
• 2.4 小結(jié)39-40
• 第三章 Eph B6對小鼠MSC成骨分化的抑制作用及機制40-56
• 3.1 材料與方法41-48
• 3.2 結(jié)果48-53
• 3.3 討論53-54
• 3.4 小結(jié)54-56
• 第四章 Eph B4/B6信號在MSC成骨分化的力學-化學信號轉(zhuǎn)化中的作用機制56-71
• 4.1 材料與方法57-62
• 4.2 結(jié)果62-67
• 4.3 討論67-70
• 4.4 小結(jié)70-71
• 全文總結(jié)71-73
• 參考文獻73-85
• 文獻綜述一 Ephrin/Eph信號在骨成形、骨重塑和骨骼疾病中的研究進展85-101
• 參考文獻92-101
• 文獻綜述二 機械應(yīng)力調(diào)控干細胞成骨分化的研究進展101-117
• 參考文獻109-117
• 在讀期間發(fā)表論文117-118
• 致謝118

【參考文獻】

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1 劉涌;周強;曹煒鵬;郭平;宋磊;蒲小兵;郭從濤;;壓應(yīng)力對組織工程骨內(nèi)人骨髓基質(zhì)細胞增殖能力影響的實驗研究[J];第三軍醫(yī)大學學報;2009年09期

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本文編號：1053756