本文選題：熒光顯微鏡　切入點(diǎn)：超分辨顯微成像　出處：《華中科技大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：光學(xué)顯微鏡以及熒光顯微鏡的特異性,非侵入性以及能夠進(jìn)行活細(xì)胞多色成像等特性,使其在生物學(xué)研究中具有很重要的作用。同時由于光具有的衍射特性,光學(xué)成像設(shè)備都存在分辨率極限。對于光學(xué)顯微鏡來說,分辨率在側(cè)向能夠達(dá)到200nm,軸向達(dá)到500nm左右。而近年來發(fā)展的超分辨顯微成像技術(shù)能夠突破傳統(tǒng)熒光顯微鏡的衍射極限限制,分辨率達(dá)到幾十納米甚至幾納米范圍,拓展了熒光顯微鏡在細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu),相關(guān)蛋白分布以及相互作用的相關(guān)研究中的應(yīng)用。 超分辨顯微鏡在近幾年取得了很大成功,與此同時如何得到更高的空間以及時間分辨率成為接下來的研究方向。本文在超分辨顯微技術(shù)的基礎(chǔ)上,介紹了在硬件以及軟件方面進(jìn)行的技術(shù)改進(jìn)工作,包括： 第二章中介紹了單分子熒光干涉測量超分辨顯微成像系統(tǒng)。通過利用單分子熒光干涉測量的方法達(dá)到提高單分子軸向定位精度的目的。 對于熒光成像技術(shù)來說,三維成像能夠得到細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的更多信息。通常對于光學(xué)顯微鏡以及超分辨顯微成像技術(shù)而言,能夠達(dá)到的軸向定位精度通常低于側(cè)向定位精度。現(xiàn)在常用的單分子軸向定位方法包括雙層成像法,柱面鏡法以及DH-PSF系統(tǒng)。這些方法都是通過改變點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的形狀來達(dá)到對Z軸位置進(jìn)行定位的目的。另外還有使用熒光干涉測量方法的iPALM和4Pi-SMS等方法,通過使用雙物鏡以及熒光干涉的方法達(dá)到更高的軸向定位精度。但是這兩種方法系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜,成本較高,國內(nèi)還沒有實(shí)驗(yàn)室建成類似的系統(tǒng)。我們通過比較幾種顯微技術(shù),設(shè)計并搭建了單分子干涉成像顯微鏡,稱為piPALM。我們在系統(tǒng)中通過使用通用部件降低了系統(tǒng)成本,在保持了熒光干涉的軸向高定位精度特性的同時,使得搭建過程更簡單。在第二章中詳細(xì)介紹了系統(tǒng)的軟硬件開發(fā)以及搭建調(diào)試過程。成像結(jié)果表明,我們的系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)單分子熒光干涉測量軸向位置,在三維方向上都能夠達(dá)到20nm以下的分辨率。 第三章主要介紹了對受限運(yùn)動狀態(tài)的單分子進(jìn)行建模并分析其運(yùn)動狀態(tài)對定位精度的影響。同時開發(fā)了基于人工神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)算法的單分子定位算法,能夠消除單分子點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)不對稱性對定位精度的影響,具有更高的魯棒性以及計算速度。 對于單分子定位超分辨顯微技術(shù)來說,單分子定位方法具有很重要作用。常用的單分子定位算法包括最小二乘法以及極大似然法。這兩種方法在擬合計算時使用的模型都是二維高斯函數(shù)。當(dāng)單分子的運(yùn)動受限制或者完全固定時,它的圖像會變得不對稱,這時使用高斯函數(shù)作為擬合模型進(jìn)行擬合就會產(chǎn)生很大的定位誤差,而離焦時會造成更大的定位誤差。在本文中,我們首次提出了限制運(yùn)動偶極子模型以及理論點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。其次,由于理論點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的數(shù)值計算過程很復(fù)雜,不適合使用傳統(tǒng)的擬合算法進(jìn)行參數(shù)估計,我們在人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法基礎(chǔ)上開發(fā)了單分子定位算法,在保持較高的精度的同時實(shí)現(xiàn)了更高的計算效率。對模擬數(shù)據(jù)和細(xì)胞樣品數(shù)據(jù)的分析結(jié)果表明,我們方法的定位誤差受單分子運(yùn)動狀態(tài)以及離焦等情況的影響小于傳統(tǒng)的單分子定位算法,能夠有效減小因?yàn)閱畏肿舆\(yùn)動狀態(tài)以及離焦等因素導(dǎo)致的定位誤差,實(shí)現(xiàn)更高的單分子定位精度。 第四章主要介紹了高密度單分子數(shù)據(jù)分析方法,通過將壓縮感知算法與雙層面成像技術(shù)的結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了高密度單分子三維定位分析,同時減小了圖像采集時間。 基于單分子定位的超分辨顯微技術(shù)能夠達(dá)到很高的分辨率,但是由于成像原理的限制,需要收集到足夠的單分子進(jìn)行圖像重構(gòu),因此樣品成像的時間較長,通常實(shí)驗(yàn)中成像時間幾分鐘到幾十分鐘左右。減少圖像采集時間的方法之一就是提高每一幀圖像中的單分子數(shù)量,但單分子密度的提高會使得單分子之間發(fā)生重疊。通過比較幾種常用的高密度單分子圖像分子方法,包括DAO-STORM和壓縮感知算法,發(fā)現(xiàn)壓縮感知算法的性能最好。同時為了實(shí)現(xiàn)三維單分子定位而又不影響單分子圖像的形狀,采用了雙層面成像技術(shù)來實(shí)現(xiàn)Z軸定位。模擬數(shù)據(jù)以及細(xì)胞樣品的成像數(shù)據(jù)分析顯示,我們的算法能夠達(dá)到10μm-1的單分子密度,同時分辨率能夠達(dá)到50nm。重構(gòu)一幅圖像只需要300幀原始圖像,將采集時間縮短到了6秒以下。 本文分別討論了使用硬件以及軟件的方法提高超分辨顯微技術(shù)的軸向,側(cè)向以及時間分辨率的方法原理,實(shí)現(xiàn)過程以及分析結(jié)果。在實(shí)際使用中,空間分辨率與時間分辨率之間會相互影響,在實(shí)際使用過程中就需要根據(jù)研究需要找到它們之間的最佳平衡點(diǎn)。本文中討論的三個部分工作都是圍繞著超分辨技術(shù)展開,擴(kuò)展了超分辨顯微技術(shù)的應(yīng)用范圍。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TP183;O439

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本文編號：1675265