本文選題：發(fā)光二極管　切入點(diǎn)：相關(guān)色溫　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分不同相關(guān)色溫的LED白光輻射對(duì)人晶體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及DNA損傷的實(shí)驗(yàn)研究目的氧化應(yīng)激造成的晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells, HLECs)損傷是白內(nèi)障形成的最重要因素之一。發(fā)光二極管(light-emitting diodes, LED)產(chǎn)生的復(fù)色白光中含有高比例的短波藍(lán)光成分,長(zhǎng)期的LED白光暴露可能造成對(duì)HLECs氧化損傷。本研究探討了不同相關(guān)色溫(correlated color temperature, CCT)的LED白光對(duì)體外培養(yǎng)的HLECs的細(xì)胞增殖,細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species, ROS), DNA損傷,細(xì)胞周期及凋亡的影響,初步探究LED光源的眼生物安全性。方法培養(yǎng)的HLECs暴露于CCT分別為2954K,5624K及7378K的LED復(fù)色白光輻射下,LED系統(tǒng)(中國(guó)鴻雁電器科技公司提供)光照循環(huán)周期為16小時(shí)-開(kāi)/8小時(shí)-關(guān)。在不同光照度及不同時(shí)間的光輻射暴露后,利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖,2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(H2DCFHDA)探針?lè)z測(cè)胞內(nèi)ROS,堿性彗星試驗(yàn)檢測(cè)DNA損傷,流式法檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡,蛋白免疫印跡及實(shí)時(shí)定量PCR (RT-qPCR)檢測(cè)PARP-1, p53及p21 mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照組相比,在1500lux的7378K LED白光刺激2天后,細(xì)胞增殖活力的顯著降低,而2954K組及5624K組未觀(guān)察到顯著性改變。在2500lux 7378KLED白光刺激3天后,HLECs的細(xì)胞活力下降68.26%；在不同光照度及輻射時(shí)間下,7378K組造成了細(xì)胞內(nèi)最為顯著的ROS增加；堿性彗星實(shí)驗(yàn)顯示2954KLED白光對(duì)DNA未造成顯著的損傷,而5624K組及7378K組DNA損傷均顯著增多；5624K及7378K 15001ux刺激2天后,HLECs出現(xiàn)G2/M期阻滯,而2954K組無(wú)顯著改變；僅7378K組在1500及25001ux光照度下可以引起顯著的細(xì)胞凋亡增多,PARP-1, p53及p21 waf1/cipl表達(dá)均顯著上升。結(jié)論與2954K及5624K LED白光相比,CCT較高的7378K LED復(fù)色白光暴露能誘導(dǎo)HLECs內(nèi)ROS的過(guò)度生成,從而抑制細(xì)胞增殖活力,造成顯著的DNA損傷,誘導(dǎo)了細(xì)胞G2/M期阻滯及凋亡。第二部分兩種不同相關(guān)色溫的LED白光輻射對(duì)人原代視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞病理性細(xì)胞因子表達(dá)影響及相關(guān)信號(hào)通路機(jī)制研究目的年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)是老年人失明的主要原因。最近的系統(tǒng)性回顧研究顯示,過(guò)度的日光(含藍(lán)光)暴露增加AMD的患病風(fēng)險(xiǎn)。隨著高效的發(fā)光二極管(light-emitting diodes, LED)發(fā)光技術(shù)在我們生活環(huán)境中的廣泛使用,LED產(chǎn)生的大量藍(lán)光對(duì)眼組織的潛在氧化應(yīng)激損傷威脅不容忽視。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)是眼組織病理性細(xì)胞因子的主要來(lái)源,調(diào)節(jié)外層視網(wǎng)膜局部炎癥反應(yīng)和血管生成。本研究探討了兩種不同相關(guān)色溫(correlated color temperature, CCT)的LED白光對(duì)分離的原代人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelial cells, RPECs)幾種病理性細(xì)胞因子表達(dá)、分泌的影響及其相關(guān)分子機(jī)制。方法采用改良的二步酶化法從從正常捐獻(xiàn)者眼球中分離人原代RPECs,以合適的細(xì)胞密度種板生長(zhǎng)至融合。CCT分別為2954K和7378 K的兩種復(fù)色白光LED以1500lux光照度,2h-開(kāi)/20min-關(guān)的光照周期輻射刺激已融合的原代細(xì)胞。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)分別檢測(cè)VEGF-A, IL-6, IL-8及MCP-1蛋白分泌及基因表達(dá)變化。采用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs),蛋白激酶B(Akt), Janus激酶(Janus kinase, JAK)和核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor-κB, NF-κB)等信號(hào)通路在LED光刺激后的活化程度。采用氯甲基-2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(CM-H2DCFDA)檢測(cè)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的水平。此外,抗氧化劑及信號(hào)通路的靶向分子抑制劑用于進(jìn)一步研究相關(guān)機(jī)制。結(jié)果我們通過(guò)改良的酶化法成功地從捐獻(xiàn)者眼杯中分離出具有生長(zhǎng)活性的原代RPECs,以適宜的種板密度使得原代細(xì)胞在體外生長(zhǎng)融合后,仍保持了RPECs的上皮表型；分離培養(yǎng)的原代RPECs基礎(chǔ)狀態(tài)下具有旺盛的細(xì)胞因子分泌特征,顯著高于永生化ARPE-19細(xì)胞株；ELISA及RT-qPCR的結(jié)果顯示7378K LED白光刺激原代RPECs刺激后,VEGF-A, IL-6及IL-8蛋白分泌及基因表達(dá)均顯著增高,MCP-1顯著降低,而2954K組未發(fā)生類(lèi)似改變；信號(hào)通路分子的免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示7378K LED白光可顯著激活MAPKs (ERK1/2, p38 MAPK及JNK1/2)及核蛋白NF-κB信號(hào)通路；機(jī)制分析提示：清除細(xì)胞內(nèi)ROS及靶向抑制MAPKs和NF-κB信號(hào)通路可顯著緩解7378K LED白光誘導(dǎo)的相關(guān)病理性細(xì)胞因子的變化。結(jié)論高CCT的7378K LED白光可通過(guò)激活MAPKs及NF-κB信號(hào)通路,造成人原代RPECs中VEGF-A, IL-6, IL-8及MCP-1的表達(dá)變化。抗氧化劑及MAPKs、 NF-κB信號(hào)通路靶向分子抑制劑可顯著緩解LED白光誘導(dǎo)的相關(guān)病理細(xì)胞因子的變化。第三部分不同相關(guān)色溫的LED白光輻射對(duì)小鼠視網(wǎng)膜組織損傷及全基因組表達(dá)譜的影響目的與傳統(tǒng)人工光源及日光光譜不同,如今普及使用的新型發(fā)光二極管(light-emitting diodes, LED)白光光譜中具有一個(gè)強(qiáng)烈的短波藍(lán)光波峰。LED產(chǎn)生的高強(qiáng)度的藍(lán)光可能存在著對(duì)視網(wǎng)膜的潛在光毒性損傷,引起人們對(duì)其生物安全性的擔(dān)憂(yōu)。通過(guò)優(yōu)化LED光譜可能有助于減少其造成的視網(wǎng)膜光毒性,本研究探討了不同相關(guān)色溫(correlated color temperature, CCT)的LED白光對(duì)小鼠視網(wǎng)膜組織損傷及視網(wǎng)膜組織全基因表達(dá)譜的影響。方法正常10周齡雌性Babl/c小鼠暴露于CCT分別為2954K,5624K及7378K的LED復(fù)色白光輻射下,以250、500、1000、3000lux光照度,刺激7天、14天及28天(光照周期為12小時(shí)-亮/12小時(shí)-暗)。在不同光照度及不同時(shí)間的LED白光輻射后,利用蘇木精伊紅(Hematein and Eosin, HE)染色檢測(cè)視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué),原位末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)法檢測(cè)視網(wǎng)膜外核層(outer nuclear layer, ONL)細(xì)胞凋亡,并采用小鼠視網(wǎng)膜Affymetrix GeneChip Mouse Genome 430 2.0全基因組表達(dá)譜芯片比較2954K及7378K兩種不同CCT的LED白光對(duì)小鼠視網(wǎng)膜基因表達(dá)的整體差異性。結(jié)果HE染色結(jié)果顯示：光輻射損傷導(dǎo)致小鼠的視網(wǎng)膜損傷主要表現(xiàn)為ONL變薄,細(xì)胞核數(shù)量減少。7378K LED白光,2501ux刺激28天后,ONL細(xì)胞核數(shù)量顯著減少。而2954K LED白光直至光照度提升至30001ux才導(dǎo)致小鼠ONL數(shù)量顯著下降,數(shù)量下降趨勢(shì)仍低于7378K組；在3000lux光照度刺激下,5624K組及7378K組小鼠ONL出現(xiàn)了顯著增多的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核,而在1000lux光照度刺激下,未觀(guān)察到顯著增多的陽(yáng)性細(xì)胞；小鼠視網(wǎng)膜全基因表達(dá)譜芯片分析顯示：7378K與對(duì)照組比較中,121個(gè)基因表達(dá)上調(diào),458個(gè)基因表達(dá)下調(diào),而在2954K與對(duì)照組比較中,59個(gè)基因表達(dá)上調(diào),僅4個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；對(duì)差異基因的GO和KEGG富集分析,7378K組的差異表達(dá)基因,參與了341個(gè)相關(guān)Term/GO,16條相關(guān)Pathway; 2954K組差異表達(dá)基因,參與12個(gè)Term/GO,7條相關(guān)Pathway。結(jié)論LED白光對(duì)小鼠視網(wǎng)膜損傷呈現(xiàn)CCT依賴(lài)性,7378K LED白光更易造成小鼠視網(wǎng)膜損傷,顯著降低ONL細(xì)胞核數(shù)量,然而細(xì)胞凋亡途徑可能并非是唯一的損傷機(jī)制。小鼠視網(wǎng)膜表達(dá)譜芯片分析結(jié)果進(jìn)一步支持了2954K及7378K兩種不同CCT的LED白光對(duì)小鼠視網(wǎng)膜影響的差異性,通過(guò)優(yōu)化CCT參數(shù)有助于提高LED光源的生物安全性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：TN312.8;R77

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本文編號(hào)：1601659