【摘要】：生物傳感器作為快速靈敏檢測生物分子的工具一直以來都是生命科學(xué)和分析化學(xué)領(lǐng)域十分關(guān)注的課題。光學(xué)傳感技術(shù)因具有靈敏度高、操作簡便、無需分離、可實現(xiàn)實時測定等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于生物分子的檢測,如酶活性、蛋白質(zhì)、核酸和生物小分子等。此外,核酸探針因其序列多變、識別多樣化、穩(wěn)定等優(yōu)點在生物傳感與生化分析新方法建立方面引起了廣泛的關(guān)注。在大量文獻調(diào)研的基礎(chǔ)上,本論文結(jié)合多種構(gòu)型的核酸探針和光學(xué)分析方法構(gòu)建了幾種光學(xué)生物傳感新方法用于檢測聚核苷酸激酶(PNK)活性,mi RNA以及與致病基因相關(guān)的DNA序列。與傳統(tǒng)方法比較,本論文所建立的傳感策略操作簡便,靈敏度高,檢測成本低,可實現(xiàn)實時測定。具體工作內(nèi)容如下:在第二章中,通過實時監(jiān)測依賴于磷酸化的DNA連接反應(yīng),我們構(gòu)建了一種無標(biāo)記的生物發(fā)光傳感器用于PNK活性的檢測。在該傳感策略中,設(shè)計了兩個帶有5’突出端的發(fā)夾DNA探針作為磷酸化受體,同時廣泛應(yīng)用的磷酸供體ATP被d CTP取代。當(dāng)不存在PNK時,由于發(fā)夾探針5’端缺乏磷酸基團而不能引發(fā)連接反應(yīng),顯示出較弱的背景信號。加入PNK時,使兩探針發(fā)生磷酸化而引發(fā)連接反應(yīng),同時釋放出AMP,隨后將AMP轉(zhuǎn)換為ATP,在熒光素酶作用下產(chǎn)生明顯的生物發(fā)光信號,通過生物發(fā)光信號的連續(xù)監(jiān)測可實現(xiàn)PNK活性的實時檢測。該檢測方法操作簡便,無需標(biāo)記,成本低廉,免受生物基質(zhì)自身熒光的干擾,還可以進一步用于PNK的定量、動力學(xué)及抑制劑研究。在第三章中,我們基于目標(biāo)分子引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)輔助的連接反應(yīng),通過生物發(fā)光法檢測連接反應(yīng)釋放出的AMP,發(fā)展了一種新的高靈敏的mi RNA均相檢測方法。當(dāng)存在靶mi RNA時,它可有效的引發(fā)兩發(fā)夾探針之間的HCR,形成帶有切口的長鏈DNA聚合物,這些切口可被連接酶共價連接,釋放出AMP產(chǎn)生發(fā)光信號,從而實現(xiàn)mi RNA的定量分析。HCR的引入不僅提高了檢測的靈敏度,而且通過核酸探針的特殊設(shè)計可為其它生物分子的檢測提供潛在平臺。重要的是,生物發(fā)光實驗以靶依賴連接副產(chǎn)物AMP轉(zhuǎn)換的ATP作為報告基團,無需復(fù)雜的熒光素酶標(biāo)記、固定、分離等步驟。該方法具有操作簡單,成本低廉,高通量,高靈敏等優(yōu)點,在實際檢測中有很大的應(yīng)用價值。在第四章中,將納米金的重力和聚合酶的識別作用相結(jié)合,構(gòu)建了一種簡單的熒光傳感方法用于靶DNA序列檢測,并選用與致病基因相關(guān)的p53序列為模型。首先,將巰基修飾的引物通過S-Au自組裝到Au NP上,當(dāng)存在目標(biāo)DNA時,探針與目標(biāo)DNA的部分序列雜交,生成的不對稱產(chǎn)物在Taq DNA聚合酶和d NTPs的輔助下,延伸形成穩(wěn)定的ds DNA螺旋結(jié)構(gòu)。最后,在連接酶的作用下將其與帶有熒光分子的ds FAM連接,離心后在沉淀中可以觀察到明顯的熒光信號,而上清液中的信號基本可以忽略。作為對照,當(dāng)目標(biāo)DNA序列中存在單堿基錯配或為任意序列時,則不能發(fā)生雜交、延伸、連接反應(yīng),從而使沉淀中基本無明顯熒光信號。該檢測方法不僅具有操作簡便,響應(yīng)快,選擇性高的優(yōu)點,而且還可用于相關(guān)酶活性的檢測。
【學(xué)位授予單位】：西北師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：O657.3;TP212.3
【圖文】：

生物傳感器的工作原理圖

速度快、分析靈敏度高、選擇性高、抗電子干擾強等特點被廣泛生物分析中。其主要是通過將待測物質(zhì)與識別單元結(jié)合過程中產(chǎn)號，通過換能器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘? 再經(jīng)放大處理獲得最終的輸出信號目標(biāo)的定性和定量分析，工作原理如圖 1.2 所示。

種靈敏檢測 T4 PNK 活性及其抑制劑的方法，如圖 1.3B 所示�；跐L環(huán)擴增的熒光核酸測定技術(shù)也得到了不斷的發(fā)展。Liu 等人[22]以 SYBR Green I 作為熒光指示劑，結(jié)合 T4 RNA ligase 2 能夠特異性區(qū)分單核苷酸多態(tài)性、滾環(huán)擴增技術(shù)發(fā)展了一種靈敏度高、選擇性高的 miRNA 分析檢測方法，如圖 1.3C所示。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

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