本文關(guān)鍵詞：馬鈴薯干旱相關(guān)microRNA的鑒定及功能研究

  更多相關(guān)文章： 馬鈴薯 MicroRNA 干旱脅迫 高通量測(cè)序 差異性分析

【摘要】：馬鈴薯是繼水稻、小麥和玉米之后的第四大主糧作物。它兼具蔬菜、糧食、飼料以及工業(yè)加工原料等多種用途,在滿足人民生活和經(jīng)濟(jì)發(fā)展方面起著至關(guān)重要的作用。然而干旱脅迫嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育品質(zhì)以及產(chǎn)量,是限制馬鈴薯生產(chǎn)最主要的非生物脅迫因素之一。植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)主要是通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生一系列生理生化反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。到目前為止,大量干旱相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平已被鑒定出來(lái)。但對(duì)其轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控研究的報(bào)道較少。MicroRNAs是一類重要的非編碼單鏈小分子RNA,通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),其調(diào)控的靶基因參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)各種非生物脅迫的響應(yīng),并且越來(lái)越多的miRNA功能相繼被鑒定出來(lái)。但這些研究主要集中在擬南芥、水稻等模式植物中,對(duì)馬鈴薯干旱相關(guān)miRNA及其靶基因的研究報(bào)道較少。本研究利用序列同源比對(duì)以及miRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析,在馬鈴薯中鑒定出3個(gè)miR159和4個(gè)miR169家族新成員以及馬鈴薯中可能參與調(diào)控干旱脅迫下脯氨酸積累代謝的miRNAs。并且通過(guò)構(gòu)建馬鈴薯耐旱型品種紫花白和干旱敏感型品種大西洋干旱處理和對(duì)照4個(gè)樣品小RNA文庫(kù)并測(cè)序,獲得了大量旱相關(guān)的miRNAs。通過(guò)構(gòu)建了馬鈴薯混合降解組文庫(kù)并測(cè)序,以及降解位點(diǎn)進(jìn)行了分析,驗(yàn)證了部分miRNA的靶基因,并對(duì)部分干旱相關(guān)重要靶基因的切割位點(diǎn)進(jìn)行了5'-RLM-RACE驗(yàn)證。本研究獲得的主要結(jié)果如下:1.基于植物miR159/169家族成員分別調(diào)控MYB和NF-YA類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控模式的保守性。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析在馬鈴薯中預(yù)測(cè)出3個(gè)miR159家族成員和4個(gè)miR169家族新成員。并通過(guò)靶基因預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)miR159可能調(diào)控R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員,miR169可能調(diào)控NF-YA轉(zhuǎn)錄因子家族成員。并通過(guò)對(duì)miR159/169s和其預(yù)測(cè)靶基因的表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下miR159/169s與其靶基因的表達(dá)模式呈負(fù)相關(guān)。因此,我們推斷在干旱脅迫下,miR159/MYB和miR169/NF-YA的調(diào)控模式在馬鈴薯中也保守。2.為了研究miRNA是否參與干旱脅迫下脯氨酸積累代謝的調(diào)控。本研究以脯氨酸代謝相關(guān)酶基因mRNA序列作為潛在的miRNA靶基因序列與miRBase中已知植物的miRNA進(jìn)行比對(duì),并獲得大量候選mi RNAs,經(jīng)過(guò)一系列的篩選和生物信息學(xué)分析,共獲得6個(gè)miRNA家族的11個(gè)miRNAs可能與馬鈴薯干旱脅迫下脯氨酸積累代謝的調(diào)控有關(guān)。結(jié)合定量PCR檢測(cè)和調(diào)控機(jī)理分析,最終獲得6個(gè)miRNA可能參與馬鈴薯干旱脅迫下脯氨酸積累代謝的調(diào)控。分別為miR172miR396cmiR396a和miR4233可能調(diào)節(jié)脯氨酸代謝酶P5CS基因,miR2673可能調(diào)節(jié)脯氨酸代謝酶P5CR基因,miR6461可能調(diào)節(jié)脯氨酸代謝酶ProDH基因。這一研究結(jié)果可以幫助我們很好的了解干旱脅迫下miRNA參與調(diào)控脯氨酸積累代謝的分子機(jī)理。3.為了在馬鈴薯全基因組水平篩選干旱相關(guān)的miRNAs,本研究通過(guò)構(gòu)建馬鈴薯耐旱型品種紫花白和干旱敏感型品種大西洋干旱處理和對(duì)照4個(gè)樣品小RNA文庫(kù)并進(jìn)行sRNA高通量測(cè)序。通過(guò)將測(cè)序結(jié)果與miRNAbase比對(duì)以及一系列生物信息學(xué)分析。最終在4個(gè)樣本中共鑒定出1,338個(gè)miRNA,其中59為馬鈴薯已知的miRNA,1,279個(gè)為馬鈴薯新預(yù)測(cè)的miRNA;并對(duì)這些miRNA進(jìn)行干旱脅迫下差異表達(dá)分析,結(jié)果表明在馬鈴薯干旱敏感型品種大西洋中有318個(gè)miRNA在干旱處理前后差異表達(dá),在馬鈴薯耐旱型品種紫花白中有89個(gè)miRNA在干旱處理前后差異表達(dá),并通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)獲得大量差異表達(dá)mi RNA的靶基因。4.miRNA功能研究的關(guān)鍵是鑒定其調(diào)控的靶基因。本研究為了更好的闡述差異表達(dá)miRNA參與干旱脅迫調(diào)控的分子機(jī)理,通過(guò)構(gòu)建馬鈴薯混合降解組文庫(kù)并測(cè)序,在馬鈴薯中共檢測(cè)到84個(gè)靶基因的90個(gè)降解位點(diǎn)發(fā)生降解。通過(guò)對(duì)靶基因的功能注釋,最終鑒定出12個(gè)mi RNA靶基因與干旱相關(guān),其中7個(gè)mi RNA靶基因獲得了5'-RLM-RACE驗(yàn)證。這些靶基因包括一些干旱相關(guān)的功能蛋白(抗壞血酸過(guò)氧化物酶,谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和泛素結(jié)合酶),信號(hào)傳導(dǎo)的激酶(絲氨酸/蘇氨酸激酶)和轉(zhuǎn)錄因子(HD-Zip類轉(zhuǎn)錄因子,SPL類轉(zhuǎn)錄因子,NAC類轉(zhuǎn)錄因子和鋅指結(jié)構(gòu)類轉(zhuǎn)錄因子)。熒光定量PCR表達(dá)分析表明,這些miRNA的表達(dá)量在馬鈴薯耐旱型品種紫花白或干旱敏感型品種大西洋干旱處理前后存在明顯的差異。以上結(jié)果表明:miRNA在馬鈴薯干旱脅迫的響應(yīng)過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：馬鈴薯 MicroRNA 干旱脅迫 高通量測(cè)序 差異性分析
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S532
【目錄】：

• 摘要2-4
• SUMMARY4-6
• 縮略語(yǔ)表6-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-30
• 1.1 植物抗旱性機(jī)制概述12-18
• 1.1.1 植物抗旱的生理機(jī)制12-13
• 1.1.2 植物抗旱的分子機(jī)理13-17
• 1.1.2.1 功能基因14-16
• 1.1.2.1.1 滲透調(diào)節(jié)劑生物合成基因14-15
• 1.1.2.1.2 細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)相關(guān)基因15-16
• 1.1.2.1.3 植物水通道蛋白基因16
• 1.1.2.1.4 蛋白酶類基因16
• 1.1.2.2 調(diào)節(jié)基因16-17
• 1.1.2.2.1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因16-17
• 1.1.2.2.2 轉(zhuǎn)錄因子類基因17
• 1.1.3 馬鈴薯的抗旱性研究17-18
• 1.2 MIRNA的概況和研究進(jìn)展18-28
• 1.2.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)18
• 1.2.2 植物miRNA的生物合成及作用方式18-19
• 1.2.3 植物miRNA的分離鑒定19-20
• 1.2.3.1 直接克隆分離法19
• 1.2.3.2 正向遺傳學(xué)鑒定法19-20
• 1.2.3.3 生物信息學(xué)的方法鑒定20
• 1.2.3.4 基因芯片鑒定法20
• 1.2.4 miRNA與植物的生長(zhǎng)發(fā)育20-22
• 1.2.4.1 miRNA參與調(diào)控植物開(kāi)花及花器官發(fā)育20-21
• 1.2.4.2 miRNA參與調(diào)控植物葉片發(fā)育21
• 1.2.4.3 miRNA參與調(diào)控植物器官形變21-22
• 1.2.4.4 miRNA參與調(diào)控植物激素信號(hào)的傳導(dǎo)22
• 1.2.5 miRNA參與自身的反饋調(diào)節(jié)22-23
• 1.2.6 miRNA與植物的養(yǎng)分脅迫23-25
• 1.2.6.1 miRNA與低磷脅迫23-24
• 1.2.6.2 miRNA與氮脅迫24
• 1.2.6.3 miRNA與硫脅迫24-25
• 1.2.6.4 miRNA與微量元素脅迫25
• 1.2.7 miRNA與植物的氧化脅迫25-26
• 1.2.8 miRNA與植物的低溫脅迫26
• 1.2.9 miRNA與植物的鹽脅迫26-27
• 1.2.10 miRNA與植物干旱脅迫27-28
• 1.3 本研究的目的和意義28-30
• 第二章 馬鈴薯MIR159/169及其靶基因的預(yù)測(cè)及表達(dá)分析30-52
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料30-31
• 2.1.1 植物材料30
• 2.1.2 數(shù)據(jù)來(lái)源30-31
• 2.1.3 分析軟件31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法31-37
• 2.2.1 馬鈴薯miR159/169的預(yù)測(cè)31-32
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)材料的生長(zhǎng)及干旱處理32
• 2.2.3 RNA的提取及檢測(cè)32-33
• 2.2.4 Stu-miR159/169s靶基因的預(yù)測(cè)及功能分析33-34
• 2.2.5 靶基因序列的生物信息學(xué)分析34
• 2.2.6 Stu-miR159/169s成熟序列的qRT-PCR表達(dá)分析34-36
• 2.2.7 預(yù)測(cè)靶基因的熒光定量PCR驗(yàn)證36-37
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-48
• 2.3.1 馬鈴薯中miR159/169家族成員的預(yù)測(cè)37-40
• 2.3.2 miR159/169靶基因的鑒定及克隆40-43
• 2.3.3 靶基因的進(jìn)化樹(shù)分析43-46
• 2.3.4 靶基因的基因結(jié)構(gòu)分析46
• 2.3.5 miR159/169通過(guò)調(diào)控MYB和NF-YA轉(zhuǎn)錄因子來(lái)響應(yīng)干旱脅迫46-48
• 2.4 討論48-52
• 2.4.1 miR159/169在馬鈴薯中也保守存在49-50
• 2.4.2 馬鈴薯miR159/169通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子MYB和NF-YA來(lái)響應(yīng)干旱脅迫50-52
• 第三章 馬鈴薯干旱脅迫下脯氨酸代謝相關(guān)MIRNAS的鑒定52-63
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料52-53
• 3.1.1 植物材料52
• 3.1.2 數(shù)據(jù)來(lái)源52-53
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法53-55
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)流程圖53
• 3.2.2 材料處理53-54
• 3.2.3 脯氨酸含量的測(cè)定54
• 3.2.4 以P5CS, P5CR和ProDH基因mRNA序列預(yù)測(cè)miRNA54
• 3.2.5 保守miRNAs在馬鈴薯中的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)54
• 3.2.6 獲得miRNAs的表達(dá)分析54-55
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-60
• 3.3.1 干旱脅迫下脯氨酸含量的變化55
• 3.3.2 預(yù)測(cè)可能調(diào)控脯氨酸代謝的miRNAs55-59
• 3.3.3 QRT-PCR表達(dá)分析篩選調(diào)控馬鈴薯脯氨酸代謝相關(guān)的miRNAs59-60
• 3.4 討論60-63
• 3.4.1 馬鈴薯不同品種抗旱性與脯氨酸積累的關(guān)系60-61
• 3.4.2 MiRNA可能參與干旱脅迫下脯氨酸的積累的調(diào)控61-63
• 第四章馬鈴薯不同耐旱型品種干旱相關(guān)的miRNAs的鑒定63-95
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料63-64
• 4.1.1 植物材料63
• 4.1.2 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件63
• 4.1.3 主要儀器63-64
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法64-69
• 4.2.1 材料處理64
• 4.2.2 RNA的提取及檢測(cè)64-65
• 4.2.3 小RNA文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序65-66
• 4.2.4 測(cè)序數(shù)據(jù)的基本分析66-67
• 4.2.5 miRNA的鑒定67-68
• 4.2.5.1 長(zhǎng)度的分類統(tǒng)計(jì)67
• 4.2.5.2 堿基偏向性分析67
• 4.2.5.3 已知的miRNAs的鑒定67
• 4.2.5.4 新miRNA的預(yù)測(cè)67-68
• 4.2.6 miRNA的差異分析68
• 4.2.7 miRNA靶基因的預(yù)測(cè)68-69
• 4.2.8 預(yù)測(cè)靶基因的功能注釋69
• 4.3 結(jié)果與分析69-93
• 4.3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析69
• 4.3.2 sRNA的Rfam注釋69-71
• 4.3.3 樣品間small RNA公共及特有序列分析71-74
• 4.3.4 sRNA長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)74-79
• 4.3.5 miRNA成熟序列的堿基偏好性分析79-80
• 4.3.6 已知miRNA的鑒定80-81
• 4.3.7 四個(gè)樣品中新預(yù)測(cè)的miRNAs81-84
• 4.3.8 miRNA靶基因的預(yù)測(cè)84-85
• 4.3.9 miRNA的差異表達(dá)分析85-90
• 4.3.9.1 差異表達(dá)miRNA的維恩圖86
• 4.3.9.2 差異表達(dá)miRNA的聚類分析86-90
• 4.3.10靶基因的功能注釋90-93
• 4.3.10.1 所有靶基因的注釋90
• 4.3.10.2 差異表達(dá)miRNA靶基因的注釋90
• 4.3.10.3 差異表達(dá)miRNA靶基因的GO分類90-91
• 4.3.10.4 差異miRNA靶基因的COG注釋91-92
• 4.3.10.5 差異miRNA靶基因的KEGG通路富集分析92-93
• 4.4 討論93-95
• 4.4.1 sRNA高通量測(cè)序?qū)悠稲NA質(zhì)量的要求93-94
• 4.4.2 高通量測(cè)序?qū)π耺iRNA的鑒定及差異表達(dá)miRNA篩選的有效性94-95
• 第五章 馬鈴薯miRNA的靶基因的鑒定95-120
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料95-96
• 5.1.1 植物材料95
• 5.1.2 軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)95-96
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法96-101
• 5.2.0 材料處理96
• 5.2.1 RNA 的提取及檢測(cè)96
• 5.2.2 轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序96-97
• 5.2.3 降解組測(cè)序數(shù)據(jù)的分析97
• 5.2.4 馬鈴薯干旱相關(guān)miRNA及其靶基因的鑒定97
• 5.2.5 干旱相關(guān)miRNA靶基因的RLM-5'RACE驗(yàn)證97-100
• 5.2.5.1 5'端接頭的連接97-98
• 5.2.5.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈98
• 5.2.5.3 巢式PCR反應(yīng)擴(kuò)增98-100
• 5.2.5.4 目的片段與T載體的連接100
• 5.2.5.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及測(cè)序100
• 5.2.6 干旱相關(guān)miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證100-101
• 5.3 結(jié)果與分析101-113
• 5.3.1 基礎(chǔ)分析101-103
• 5.3.1.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)101-102
• 5.3.1.2 非編碼RNA注釋102-103
• 5.3.2 降解位點(diǎn)分析103-106
• 5.3.3 馬鈴薯干旱相關(guān)miRNA靶基因的 5’RACE驗(yàn)證106-110
• 5.3.4 馬鈴薯干旱相關(guān)miRNA的熒光定量分析110-113
• 5.4 討論113-120
• 5.4.1 降解組測(cè)序鑒定馬鈴薯miRNA靶基因的有效性113-114
• 5.4.2 MiRNA參與調(diào)控馬鈴薯對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)114-119
• 5.4.3 后期的實(shí)驗(yàn)安排119-120
• 結(jié)論120-121
• 參考文獻(xiàn)121-138
• 致謝138-139
• 作者簡(jiǎn)介139-140
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介140-141
• 附錄141-204

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

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本文編號(hào)：985729