本文關鍵詞：用RNA-seq技術鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛安全性的影響

  更多相關文章： Bt水稻 擬環(huán)紋豹蛛 毒腺 功能反應 繁殖能力 生長發(fā)育 酶活 轉錄組

【摘要】：近年來,轉Bt基因糧食作物對害蟲的控蟲作用受到廣泛的應用,它可以減少廣譜殺蟲劑對環(huán)境造成的污染。水稻作為亞洲國家主要的糧食作物,正面對嚴重的蟲害問題和殺蟲劑污染問題。因此,轉Bt基因水稻逐漸被用來緩解這種局勢。轉Bt基因水稻給環(huán)境與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大利益的同時,其潛在的危險同樣受到關注。Bt蛋白在稻田生態(tài)系統(tǒng)復雜的食物網(wǎng)中的傳遞,以及對非靶標生物的影響是人們擔憂的主要問題之一。本研究就試圖利用轉錄組高通量測序技術鑒定Bt水稻對稻田蜘蛛優(yōu)勢種擬環(huán)紋豹蛛(Pardosa pseudoannulata)安全性的影響。內容具體如下：1.用RNA-seq技術鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛捕食功能及搜尋行為的影響為了探究Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛捕食功能的影響及其機理。用富集Bt蛋白的褐飛虱飼養(yǎng)擬環(huán)紋豹蛛,比較富集過Bt蛋白的擬環(huán)紋豹蛛與正常蜘蛛捕食功能以及搜尋行為差異,并解剖擬環(huán)紋豹蛛的神經(jīng)節(jié)做轉錄組分析,觀察Bt蛋白作用下神經(jīng)節(jié)基因的表達情況。同時,隨機選擇了4個DEGs基因進行了qPCR驗證。結果表明,Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛的捕食功能沒有影響,但會顯著增強擬環(huán)紋豹蛛的搜尋行為。結合轉錄組分析,神經(jīng)細胞內氧化磷酸化反應顯著增強可能是擬環(huán)紋豹蛛變得興奮的關鍵因素,而其體內一些次級代謝產(chǎn)物代謝途徑的富集可能與蜘蛛體內對Bt蛋白的防御機制相關,其轉錄組結果與qPCR驗證結果一致。2.用RNA-seq技術鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛毒腺基因表達的影響B(tài)t蛋白是一種殺蟲晶體蛋白,能與昆蟲腸道上皮細胞上的特異性蛋白結合,導致膜上孔洞的形成,造成昆蟲的死亡。本研究利用轉錄組高通量測序技術,對富集了Bt蛋白的擬環(huán)紋豹蛛毒腺與正常擬環(huán)紋豹蛛毒腺進行了深度測序,得到113358條unigene。通過比對COG, GO, KEGG等數(shù)據(jù)庫,對擬環(huán)紋豹蛛毒腺基因進行功能注釋,并且探究了在兩樣本中差異表達的基因。其中上調基因3765條,下調基因3157條,主要參與的代謝途徑為氧化磷酸化途徑、核糖體等相關途徑。本研究初步證明Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛毒腺基因表達有一定影響。同時也為全方面了解蜘蛛毒腺基因組以及基因進化提供了幫助。3.用RNA-seq技術鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛生長發(fā)育的影響為了探究Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛生長發(fā)育的影響及其機制,通過ELISA檢測來探究Bt蛋白在擬環(huán)紋豹蛛成蛛和3齡,5齡幼蛛體內各組織中的富集規(guī)律；分別記錄實驗組和對照組幼蛛的發(fā)育歷期,體長、背甲寬、體重變化,取食量,存活率等參數(shù)；比較兩組成蛛和幼蛛體內三大組織(肌肉組織,消化組織,神經(jīng)節(jié))及其亞細胞結構中5種解毒酶(POD, CAT, SOD, GSH-Px, AChE)酶活的活性。取5齡幼蛛做轉錄組測序分析,通過差異表達分析和功能注釋了解Bt蛋白作用下實驗組蜘蛛差異表達基因的生物學功能,探究Bt蛋白影響幼蛛生長發(fā)育的分子機制。同時,隨機選擇了4個DEGs基因進行了qPCR驗證。結果表明,Bt蛋白可以在擬環(huán)紋豹蛛的各組織結構和亞細胞結構中富集,并會影響到擬環(huán)紋豹蛛的生長發(fā)育和兩種關鍵的的酶,AChE和POD。轉錄組分析結果表明,幼蛛體內一些直接調控生長發(fā)育的生物學功能的改變,如生長激素受體信號途徑,幼體發(fā)育,幼體齡期的發(fā)育,中腸的發(fā)育,體肌的發(fā)育等是造成發(fā)育顯著延遲,體重降低的主要原因；還有一些供能物質代謝途徑的改變,如糖酵解糖異生,三羧酸循環(huán),氧化磷酸化,淀粉蔗糖的代謝,脂肪酸代謝等可能間接影響到幼蛛體內解毒酶的活性,進而直接或間接的影響到幼蛛的生長發(fā)育。其轉錄組結果與qPCR驗證結果一致。4.用RNA-seq技術鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛繁殖的影響實驗室條件下研究了Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛繁殖能力的影響及其分子機制。以分別取食Bt水稻或正常水稻15天的褐飛虱喂食擬環(huán)紋豹蛛,比較兩組蜘蛛的繁殖能力(產(chǎn)卵前期、產(chǎn)卵量、卵袋數(shù)、孵化率)是否有差異,在宏觀層面上探究Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛繁殖能力的影響；取蜘蛛性腺做轉錄組分析,研究性腺中繁殖相關基因的表達是否受到影響,從分子層面上解釋Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛的作用機制。同時,我們對8個卵黃蛋白基因進行了qPCR驗證。結果表明,Bt蛋白可以沿著食物鏈傳遞,從水稻通過褐飛虱在擬環(huán)紋豹蛛體內富集,其最大富集量為0.396ng/g,而擬環(huán)紋豹蛛的繁殖能力不受Bt蛋白的影響�；虿町惐磉_分析顯示,性腺中直接調控繁殖的有806個unigene,這些unigene參與到23種不同的生物學功能和4條代謝途徑,且都沒有差異表達；而以FDR0.01, log2fold change2篩選得到的49個顯著差異表達基因參與到的生物學功能和代謝途徑都不與蜘蛛的繁殖直接相關。在Cry1Ab蛋白脅迫下,8個與卵黃蛋白合成相關的基因均未發(fā)生表達差異,其轉錄組結果與qPCR驗證結果一致。因此,Bt蛋白不影響擬環(huán)紋豹蛛的繁殖能力,其主要原因是性腺中繁殖相關基因的表達并沒有受到影響。
【關鍵詞】：Bt水稻 擬環(huán)紋豹蛛 毒腺 功能反應 繁殖能力 生長發(fā)育 酶活 轉錄組
【學位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S476.2
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 第一章 緒論14-26
• 1 問題的提出14-15
• 2 轉Bt基因作物15-23
• 2.1 Bt蛋白簡介15-16
• 2.2 轉Bt基因作物16-17
• 2.3 轉Bt基因作物對靶標生物影響的研究17-19
• 2.4 轉Bt基因作物對非靶標生物影響的研究19-23
• 3 蜘蛛23-24
• 4 轉錄組高通量測序技術(RNA-seq技術)24-26
• 第二章 用轉錄組高通量測序技術鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛捕食功能及搜尋行為的影響26-39
• 1 材料與方法26-28
• 1.1 實驗用水稻26
• 1.2 供試褐飛虱26
• 1.3 實驗用蜘蛛及其處理26
• 1.4 Bt蛋白含量測定26-27
• 1.5 捕食功能反應27
• 1.6 搜尋反應27
• 1.7 轉錄組測序27
• 1.8 qPCR分析(實時熒光定量PCR)27-28
• 1.9 數(shù)據(jù)處理28
• 2 結果與分析28-36
• 2.1 擬環(huán)紋豹蛛體內Cry1Ab蛋白含量隨天數(shù)變化28-29
• 2.2 捕食功能反應29-30
• 2.3 搜尋反應30
• 2.4 轉錄組Unigene差異分析30-35
• 2.5 DEGs基因的qPCR分析35-36
• 3 結論與討論36-39
• 第三章 用轉錄組高通量測序技術鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛毒腺基因表達的影響39-48
• 1 材料與方法39-41
• 1.1 實驗水稻39
• 1.2 稻飛虱養(yǎng)殖39
• 1.3 蜘蛛采集和分裝39
• 1.4 試劑及試劑盒39-40
• 1.5 蜘蛛的飼養(yǎng)40
• 1.6 Bt蛋白檢測40
• 1.7 蜘蛛毒腺解剖40
• 1.8 RNA的提取40-41
• 1.9 RNA質量檢測41
• 1.10 測序41
• 1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計41
• 2 結果與分析41-46
• 2.1 蜘蛛體內Bt蛋白含量41
• 2.2 擬環(huán)紋豹蛛的毒腺41
• 2.3 RNA質量檢測41-42
• 2.4 差異表達分析42-46
• 3 討論46-48
• 第四章 用轉錄組高通量測序技術鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛生長發(fā)育的影響48-67
• 1 材料與方法49-51
• 1.1 供試水稻49
• 1.2 供試飛虱49
• 1.3 供試蜘蛛49
• 1.4 CrylAb蛋白檢測49-50
• 1.5 酶活的測定50
• 1.6 轉錄組分析50
• 1.7 qPCR分析50
• 1.8 數(shù)據(jù)分析50-51
• 2 結果與分析51-64
• 2.1 Cry1Ab蛋白在擬環(huán)紋豹蛛體內的生物富集51
• 2.2 Cry1Ab蛋白對幼蛛發(fā)育歷期、存活率和體重增長的影響51-53
• 2.3 Cry1Ab蛋白對幼蛛身體發(fā)育的影響53-54
• 2.4 Cry1Ab蛋白對成蛛體內各組織以及其亞細胞結構中各酶活的影響54-57
• 2.5 Cry1Ab蛋白對幼蛛體內各組織及亞細胞結構中各酶活的影響57-59
• 2.6 轉錄組結果分析59-63
• 2.7 DEGs基因的qPCR分析63-64
• 3. 討論64-67
• 第五章 用轉錄組高通量測序技術鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛繁殖的影響67-80
• 1 材料與方法68-70
• 1.1 水稻68
• 1.2 褐飛虱68
• 1.3 蜘蛛的飼養(yǎng)68
• 1.4 Cry1Ab的檢測68-69
• 1.5 基因表達分析與功能注釋69
• 1.6 qPCR檢測69-70
• 1.7. 數(shù)據(jù)分析70
• 2 結果與分析70-76
• 2.1 Cry1Ab蛋白在擬環(huán)紋豹蛛體內的富集規(guī)律70-71
• 2.2 Cry1Ab蛋白對擬環(huán)紋豹蛛繁殖能力的影響71
• 2.3 基因表達分析71-75
• 2.4 卵黃蛋白基因的qPCR分析75-76
• 3 討論76-80
• 第六章 結論、創(chuàng)新與展望80-82
• 1 結論80
• 2 創(chuàng)新點80-81
• 3 展望81-82
• 參考文獻82-98
• 附錄A：RNA質檢結果98-100
• 附錄B：轉錄組建庫流程及Reads質量預處理100-103
• 附錄C103-105
• 致謝105-106

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