本文關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹螺原體磷脂代謝和精氨酸代謝中幾種關(guān)鍵蛋白的功能研究

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【摘要】：中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖種類,近年來(lái),隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和集約化程度的不斷提高,由細(xì)菌、病毒和寄生蟲等病原引起的各種病害日益嚴(yán)重,給中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。其中顫抖病是中華絨螯蟹中最為嚴(yán)重的病害,王文等的前期研究證明顫抖病的病原為一種特殊的細(xì)菌——螺原體,并正式命名為中華絨螯蟹螺原體(Spiroplasma eriocheiris)。S. eriocheiris不僅可以感染其自然界宿主中華絨螯蟹,還可以感染雞胚和新生小鼠,引起小鼠白內(nèi)障的病癥,這與非凡螺原體(Spiroplasma mirum)可以引起嚙齒類新生個(gè)體(包括新生小鼠)患白內(nèi)障的病癥非常相似。前期研究對(duì)S. eriocheiris生理生化性質(zhì)、分類地位、病原檢測(cè)、敏感藥物的篩選和有效治療藥物的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究,以及分別構(gòu)建了中華絨螯蟹螺原體侵染脊椎動(dòng)物小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(3T6細(xì)胞)模型和侵染無(wú)脊椎動(dòng)物中華絨螯蟹血細(xì)胞模型。但是有關(guān)其分子生物學(xué)和主要蛋白功能方面的研究還處于前期階段。因此,本博士學(xué)位論文在前期中華絨螯蟹螺原體基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上,利用比較基因組學(xué),篩選和鑒定與中華絨螯蟹螺原體與致病相關(guān)的毒力因子、能量代謝以及侵染機(jī)制相關(guān)蛋白,這些工作為下一步研究中華絨螯蟹螺原體分子水平致病機(jī)制打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。1.中華絨螯蟹螺原體溶血磷脂酶SE-LsyoPL基因的生物信息學(xué)分析及其克隆、表達(dá)純化以及酶活性質(zhì)的分析通過(guò)對(duì)中華絨螯蟹螺原體基因組進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹螺原體中僅含有一種磷脂酶——溶血磷脂酶(Lysophospholipase)并將之命名為SE-LsyoPLA,該序列全長(zhǎng)927bp,編碼一個(gè)308個(gè)氨基酸的蛋白,預(yù)測(cè)的蛋白分子量和等電點(diǎn)分別是35 kDa和pI 9.64。生物信息學(xué)分析,其氨基酸序列含有典型的GXSXG序列,三級(jí)結(jié)構(gòu)中Ser-Asp-His三個(gè)氨基酸組成了催化三聯(lián)體。對(duì)SE-LsyoPL基因進(jìn)行成功克隆,點(diǎn)突變,進(jìn)行原核表達(dá),蛋白純化。通過(guò)水解對(duì)硝基酚酯類p-NP palmitate實(shí)驗(yàn)分析重組蛋白的酶活性,結(jié)果顯示SE-LsyoPL的最適的pH值為7.0左右,最適溫度為30℃；在不同溫度下的熱穩(wěn)定性分析結(jié)果表明,在0-30℃溫度范圍內(nèi)酶活力較為穩(wěn)定,當(dāng)溫度升高至50℃時(shí),SE-LsyoPL已基本失活,說(shuō)明SE-LsyoPL是一種溫和的、中性的磷脂酶�？疾觳煌饘匐x子對(duì)SE-LsyoPL酶活力的影響,Ca2+和Mn2+對(duì)酶的活性沒(méi)有影響。本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)SE-LsyoPL對(duì)于長(zhǎng)鏈脂肪酸的水解能力強(qiáng),但是對(duì)于短鏈脂肪酸的水解能力弱。2.中華絨螯蟹螺原體溶血磷脂酶(SE-LsyoPL)功能分析利用已經(jīng)純化的SE-LsyoPL的重組蛋白成功地制備了SE-LsyoPL的多克隆抗體,采用間接ELISA法檢測(cè)抗血清的效價(jià),SE-LsyoPL抗血清的效價(jià)在1：70000左右。實(shí)驗(yàn)中利用超高速離心的方法成功的提取了S. eriocheiris膜蛋白,利用Western blotting分析表明,SE-LsyoPL是螺原體的一種膜蛋白。實(shí)驗(yàn)中采用已經(jīng)成熟的S. eriocheiri體外侵染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(3T6細(xì)胞)的模型進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),采用抗體中和實(shí)驗(yàn)封閉S. eriocheiri表面的SE-LsyoPL酶位點(diǎn)來(lái)觀察螺原體侵染能力的變化。土霉素法檢測(cè)表明,當(dāng)SE-LsyoPL抗體濃度為20 μg/ml時(shí),螺原體在前期對(duì)3T6細(xì)胞的侵染率明顯下降,螺原體侵染至48h后抗體中和實(shí)驗(yàn)組與螺原體侵染組中螺原體的侵染率沒(méi)有顯著差異(P0.05)；當(dāng)SE-LsyoPL抗體濃度為2 μg/ml時(shí),螺原體的侵染率并沒(méi)有顯著變化。采用流式細(xì)胞技術(shù),進(jìn)一步分析抗體中和實(shí)驗(yàn)組(SE-LsyoPL抗體濃度為20 μg/mL)和螺原體侵染組中細(xì)胞凋亡情況。螺原體侵染48h后,中和實(shí)驗(yàn)組中的早期細(xì)胞凋亡率要明顯低于螺原體侵染組(P0.05),正常細(xì)胞的數(shù)量也明顯的高于螺原體侵染組(P0.05),并且中和實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞形態(tài)較好。采用間接免疫熒光電鏡技術(shù),觀察螺原體對(duì)3T6細(xì)胞的侵染情況,結(jié)果表明在接種螺原體48h后抗體中和實(shí)驗(yàn)組中螺原體的分布主要成零星的點(diǎn)狀分布,主要在宿主細(xì)胞的胞膜上分布且綠色熒光微弱。而在螺原體侵染組中可以看到大量螺原體侵染到宿主細(xì)胞內(nèi)部并成團(tuán)狀分布,形成包涵體且熒光強(qiáng)度高,表明螺原體的侵染要明顯的高于中和實(shí)驗(yàn)組。研究表明,當(dāng)螺原體表面的SE-LsyoPL酶位點(diǎn)被抗體封閉時(shí),螺原體的侵染率明顯下降。3.中華絨螯蟹螺原體的生長(zhǎng)特性以及對(duì)精氨酸利用的研究本實(shí)驗(yàn)中首先利用了一種簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基R8-1對(duì)S. eriocheiris生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究,研究表明螺原體能很好生長(zhǎng)于R8-1培養(yǎng)基中,S. eriocheiris的最適生長(zhǎng)溫度為30-32℃,最高生長(zhǎng)溫度約42℃。S. eriocheiris最適pH為7.2-7.6,最低耐受約pH約5.0,最高耐受pH高達(dá)10.0。培養(yǎng)基中添加20 mM/L精氨酸時(shí),發(fā)現(xiàn)螺原體的生長(zhǎng)速度要明顯高于沒(méi)有添加精氨酸的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度,繼續(xù)培養(yǎng)時(shí),添加精氨酸組的平臺(tái)期的要明顯變長(zhǎng)。高效液相色譜(HPLC)對(duì)螺原體利用精氨酸的情況進(jìn)行分析,在培養(yǎng)的前期螺原體并不能利用精氨酸,而到了平臺(tái)期以后螺原體才能逐漸的開(kāi)始利用精氨酸,并且此時(shí)培養(yǎng)基中瓜氨酸和鳥(niǎo)氨酸兩種氨基酸呈明顯上升趨勢(shì),說(shuō)明此時(shí)螺原體能夠很好的利用精氨酸作為能源物質(zhì)。4.中華絨螯蟹螺原體精氨酸脫亞胺酶(Arginine dei mi nase, ADI)系統(tǒng)中關(guān)鍵基因的生物信息學(xué)分析及其克隆、表達(dá)純化和功能分析通過(guò)基因組學(xué)研究表明,S. eriocheiris基因組中含有一條典型的精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase, ADI)系統(tǒng),并包含完整的基因簇,通過(guò)生物信息學(xué)分析表明ADI系統(tǒng)含有精氨酸脫亞胺酶(ADI),鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(OTC),精氨酸鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因(AOA)和氨甲酰激酶(CK)四個(gè)酶。首先對(duì)ADI系統(tǒng)中三種關(guān)鍵的蛋白——精氨酸脫亞胺酶(ADI)、鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(OTC)和氨甲酰激酶(CK)進(jìn)行基因進(jìn)行克隆、點(diǎn)突變、重組蛋白原核表達(dá)、蛋白純化以及多克隆抗體的制備。通過(guò)Western blotting分析發(fā)現(xiàn)CK和OTC兩種酶是在S. eriocheiris的細(xì)胞膜上具有分布。在不同pH、不同溫度、培養(yǎng)基中添加精氨酸和不同濃度葡萄糖的條件下,利用RealTime-PCR和Western blotting技術(shù),從分子層面上研究S. eriocheiris在不同環(huán)境條件下ADI系統(tǒng)關(guān)鍵酶的基因水平和蛋白水平表達(dá)量變化情況,結(jié)果表明ADI系統(tǒng)在高溫和酸性(pH=5)等不良的環(huán)境下,ADI系統(tǒng)中基因的表達(dá)量明顯上調(diào),蛋白的表達(dá)量顯著升高。但在培養(yǎng)基中高濃度糖類時(shí),ADI系統(tǒng)卻會(huì)被明顯的抑制。綜合結(jié)果表明精氨酸代謝系統(tǒng)在S. eriocheiris能量代謝和抗逆過(guò)程中起到重要的作用。5.中華絨螯蟹螺原體鯡精胺脫亞胺酶(Agmatine deiminase, AgDI)系統(tǒng)中關(guān)鍵基因的生物信息學(xué)分析及其克隆、表達(dá)純化和功能的分析研究發(fā)現(xiàn)S. eriocheiris基因組中還含有一條完整的鯡精胺脫亞胺(Agmatine deiminase, AgDI)系統(tǒng),基因簇中含有完整的基因包括鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)、胍丁胺-腐胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(A/P)和腐胺氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(PTC)。首先對(duì)AgDI系統(tǒng)中兩種關(guān)鍵的蛋白鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(PTC)進(jìn)行基因克隆、點(diǎn)突變、重組蛋白原核表達(dá)、蛋白純化以及多克隆抗體的制備。利用RealTime-PCR和Western blotting方法從分子層面上研究S. eriocheiris在不同環(huán)境條件下(不同pH環(huán)境、不同溫度及不同濃度葡萄糖條件下)AgDI系統(tǒng)關(guān)鍵酶的基因水平和蛋白水平表達(dá)量變化,結(jié)果表明AgDI系統(tǒng)在酸性(pH=5)不良的環(huán)境下,AgDI系統(tǒng)中基因的表達(dá)量明顯上調(diào),蛋白的表達(dá)量顯著升高,但是在高溫情況下,AgDI酶的表達(dá)量并沒(méi)有明顯升高,表明AgDI系統(tǒng)在高溫下沒(méi)有被明顯的激活。在當(dāng)培養(yǎng)基中高濃度糖類存在的條件下,AgDI系統(tǒng)卻會(huì)被明顯的抑制。結(jié)果表明鯡精胺脫亞胺酶系統(tǒng)在S. eriocheiris能量代謝和抵抗pH過(guò)程中起到重要的作用,但是在高溫條件下沒(méi)有明顯的變化。
【關(guān)鍵詞】：中華絨螯蟹螺原體 溶血磷脂酶 精氨酸 精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng) 鯡精胺脫亞胺酶系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S945
【目錄】：

• 摘要3-7
• Abstract7-17
• 第一章 緒論17-41
• 1.1 螺原體的發(fā)現(xiàn)、分類、生物學(xué)特性和致病機(jī)理的研究17-23
• 1.1.1 螺原體的發(fā)現(xiàn)與相關(guān)報(bào)道17-19
• 1.1.2 螺原體的基本生物學(xué)特性19-21
• 1.1.3 螺原體的分布及其致病性21-22
• 1.1.4 螺原體致病機(jī)制的研究進(jìn)展22-23
• 1.2 中華絨螯蟹螺原體的研究進(jìn)展23-26
• 1.2.1 中華絨螯蟹顫抖病的流行病學(xué)調(diào)查23
• 1.2.2 中華絨螯蟹螺原體的研究進(jìn)展23-26
• 1.3 柔膜體綱細(xì)菌基因組學(xué)研究進(jìn)展26-32
• 1.3.1 螺原體比較基因組學(xué)研究28-29
• 1.3.2 螺原體的基本代謝特征29-32
• 1.4 磷脂酶的研究進(jìn)展32-35
• 1.4.1 磷脂酶的分類32
• 1.4.2 磷脂酶的致病作用機(jī)理32
• 1.4.3 溶血磷脂酶32-35
• 1.5 精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase,ADI)系統(tǒng)和精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase,AgDI)系統(tǒng)的研究進(jìn)展35-39
• 1.5.1 精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase,ADI)系統(tǒng)的生理功能35-37
• 1.5.2 精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase,ADI)系統(tǒng)的致病作用37-38
• 1.5.4 鯡精胺脫亞胺酶(Agmatine deiminase,AgDI)系統(tǒng)38-39
• 1.6 本論文的研究目的、內(nèi)容、意義和技術(shù)路線39-41
• 第二章 中華絨螯蟹螺原體溶血磷脂酶SE-LsyoPL基因的生物信息學(xué)分析及其克隆、表達(dá)純化以及酶活性質(zhì)的分析41-62
• 2.1 材料41-45
• 2.1.1 主要設(shè)備41-42
• 2.1.2 主要試劑42-44
• 2.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成44-45
• 2.2 方法45-69
• 2.2.1 序列分析45-115
• 2.2.2 中華絨螯蟹螺原體基因組DNA的提取115-45
• 2.2.3 SE-LsyoPL基因PCR擴(kuò)增45-46
• 2.2.4 SE-LsyoPL基因與pUC載體的連接46
• 2.2.5 pUC-SE-LsyoPL連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化46
• 2.2.6 菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆、測(cè)序分析46
• 2.2.7 點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)46-48
• 2.2.8 構(gòu)建表達(dá)載體48
• 2.2.9 表達(dá)重組蛋白及鑒定48-95
• 2.2.10 Western blot分析蛋白表達(dá)結(jié)果確定目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功95-49
• 2.2.11 Ni-NTA Agarose親和層析49-50
• 2.2.12 中華絨螯蟹溶血磷脂酶(SE-LsyoPL)的活力測(cè)定和蛋白含量測(cè)定50
• 2.2.13 酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定50-51
• 2.2.14 重組酶的底物特異性51-69
• 2.3 結(jié)果69-59
• 2.3.1 中華絨螯蟹螺原體基因組DNA的提取、SE-LsyoPL基因PCR擴(kuò)增及序列分析115-55
• 2.3.2 中華絨螯蟹螺原體SE-LsyoPL基因的點(diǎn)突變55
• 2.3.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建55-56
• 2.3.4 重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定56
• 2.3.5 重組中華絨螯蟹磷脂酶(SE-LsyoPL)的酶學(xué)性質(zhì)56-58
• 2.3.6 重組中華絨螯蟹磷脂酶(SE-LsyoPL)的底物特異性58-59
• 2.4 討論59-62
• 第三章 中華絨螯蟹螺原體溶血磷脂酶(SE-LsyoPL)功能分析62-79
• 3.1 主要實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑62-64
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料62-63
• 3.1.2 主要儀器和耗材63
• 3.1.3 主要試劑配方63-64
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法64-69
• 3.2.1 制備多克隆抗體與其效價(jià)檢測(cè)64-65
• 3.2.2 Western blotting分析65
• 3.2.3 中華絨螯蟹螺原體總蛋白和膜蛋白的提取65-66
• 3.2.4 3T6細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與侵染66-67
• 3.2.5 SE-LsyoPL抗體中和實(shí)驗(yàn)67
• 3.2.6 間接免疫熒光法標(biāo)記定位67-68
• 3.2.7 土霉素法檢測(cè)侵染率68
• 3.2.8 利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)螺原體感染后3T6細(xì)胞的細(xì)胞凋亡68-69
• 3.3 結(jié)果69-76
• 3.3.1 SE-LsyoPL重組蛋白多克隆抗體制備與效價(jià)檢測(cè)69-70
• 3.3.2 螺原體總蛋白、膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白SDS-PAGE及Western blotting分析70-72
• 3.3.3 土霉素法檢測(cè)中華絨螯蟹螺原體S.eriocheiris侵染比例以及中和實(shí)驗(yàn)侵染結(jié)果72-73
• 3.3.4 3T6細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與侵染結(jié)果73-75
• 3.3.5 間接免疫熒光法標(biāo)記定位結(jié)果75-76
• 3.4 討論76-79
• 第四章 中華絨螯蟹螺原體生長(zhǎng)特性及對(duì)精氨酸利用的研究79-92
• 4.1 主要實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑79-80
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料79
• 4.1.2 主要儀器和耗材79-80
• 4.1.3 主要試劑配方80
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法80-83
• 4.2.1 高效液相色譜法測(cè)定中華絨螯蟹螺原體對(duì)精氨酸的利用情況80-81
• 4.2.2 中華絨螯蟹螺原體計(jì)數(shù)--顏色改變單位法(colour change unit,簡(jiǎn)稱CCU)81-82
• 4.2.3 中華絨螯蟹螺原體生長(zhǎng)曲線測(cè)定82
• 4.2.4 溫度對(duì)中華絨螯蟹螺原體生長(zhǎng)的影響82
• 4.2.5 pH對(duì)中華絨螯蟹螺原體生長(zhǎng)的影響82
• 4.2.6 培養(yǎng)基中添加精氨酸對(duì)對(duì)中華絨螯蟹螺原體生長(zhǎng)的影響82-83
• 4.3 結(jié)果83-90
• 4.3.1 R8-1培養(yǎng)基中溫度對(duì)中華絨螯蟹螺原體生長(zhǎng)的影響83
• 4.3.2 pH對(duì)中華絨螯蟹螺原體生長(zhǎng)的影響83-84
• 4.3.3 R8-1培養(yǎng)基中添加精氨酸對(duì)中華絨螯蟹螺原體生長(zhǎng)的影響84-85
• 4.3.4 高效液相色譜法測(cè)定中華絨螯蟹螺原體對(duì)精氨酸的利用情況85-90
• 4.4 討論90-92
• 第五章 中華絨螯蟹螺原體精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase,ADI)系統(tǒng)中關(guān)鍵基因的生物信息學(xué)分析及其克隆、表達(dá)純化和功能的分析92-114
• 5.1 材料93
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器93
• 5.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑93
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法93-98
• 5.2.1 序列分析93
• 5.2.2 中華絨螯蟹螺原體基因組DNA的提取93
• 5.2.3 螺原體培養(yǎng)93-94
• 5.2.4 精氨酸脫亞胺酶中關(guān)鍵基因——精氨酸脫亞胺酶(ADI),鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(OTC),氨甲酰激酶(CK)的PCR擴(kuò)增94-95
• 5.2.5 精氨酸脫亞胺酶(ADI),鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(OTC),氨甲酰激酶(CK)基因與pUC19載體的連接95
• 5.2.6 pUC-ADI,OTC和CK連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化95
• 5.2.7 菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆、測(cè)序分析95
• 5.2.8 點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)95
• 5.2.9 表達(dá)載體的構(gòu)建95
• 5.2.10 重組蛋白的表達(dá)與鑒定95
• 5.2.11 Western blot分析蛋白表達(dá)結(jié)果確定目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功95
• 5.2.12 Ni-NTA Agarose親和層析95
• 5.2.13 多克隆抗體的制備與效價(jià)檢測(cè)95
• 5.2.14 中華絨螯蟹螺原體螺原體總蛋白和膜蛋白的提取95
• 5.2.15 RNA提取95-96
• 5.2.16 去除DNA96-97
• 5.2.17 反轉(zhuǎn)錄97
• 5.2.18 Real Time PCR反應(yīng)97-98
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果98-111
• 5.3.1 中華絨螯蟹螺原體基因組DNA的提取,精氨酸脫亞胺酶(ADI),鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(OTC),氨甲酰激酶(CK)基因PCR擴(kuò)增及序列分析98-102
• 5.3.2 中華絨螯蟹螺原體精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)中基因的點(diǎn)突變102
• 5.3.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建102
• 5.3.4 重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定102-103
• 5.3.5 精氨酸脫亞胺酶(ADI),鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(OTC),氨甲酰激酶(CK)重組蛋白多克隆抗體制備與效價(jià)檢測(cè)及Western blotting分析103-105
• 5.3.6 中華絨螯蟹螺原體精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)中基因Real time RTPCR分析105-110
• 5.3.7 中華絨螯蟹螺原體精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)中關(guān)鍵酶在不同條件下蛋白表達(dá)量的分析110-111
• 5.4 討論111-114
• 第六章 中華絨螯蟹螺原體鯡精胺脫亞胺酶(Agmatine deiminase,AgDI)系統(tǒng)中關(guān)鍵基因的生物信息學(xué)分析及其克隆、表達(dá)純化和功能的分析114-128
• 6.1 材料115
• 6.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器93-115
• 6.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑115
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法115-117
• 6.2.1 序列分析115
• 6.2.2 中華絨螯蟹螺原體基因組DNA的提取115
• 6.2.3 螺原體培養(yǎng)115
• 6.2.4 鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)通路中關(guān)鍵基因——鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(PTC)的PCR擴(kuò)增115-116
• 6.2.5 鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(PTC)與pUC19載體的連接116
• 6.2.6 pUC-AgDI和PTC連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化116
• 6.2.7 菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆、測(cè)序分析116
• 6.2.8 點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)116
• 6.2.9 表達(dá)載體的構(gòu)建116
• 6.2.10 重組蛋白的表達(dá)與鑒定116
• 6.2.11 Western blot分析蛋白表達(dá)結(jié)果確定目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功116-117
• 6.2.12 Ni-NTA Agarose親和層析117
• 6.2.13 多克隆抗體的制備與效價(jià)檢測(cè)117
• 6.2.14 RNA提取117
• 6.2.15 去除DNA117
• 6.2.16 測(cè)量RNA濃度117
• 6.2.17 反轉(zhuǎn)錄117
• 6.2.18 Real Time PCR反應(yīng)117
• 6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果117-126
• 6.3.1 中華絨螯蟹螺原體基因組DNA的提取,鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(PTC)基因PCR擴(kuò)增及序列分析117-120
• 6.3.2 中華絨螯蟹螺原體AgDI系統(tǒng)中基因的點(diǎn)突變120
• 6.3.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建120
• 6.3.4 重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定120-121
• 6.3.5 鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(PTC)重組蛋白多克隆抗體制備與效價(jià)檢測(cè)121-122
• 6.3.6 中華絨螯蟹螺原體鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)系統(tǒng)中基因Real timeRT-PCR分析122-125
• 6.3.7 中華絨螯蟹螺原體精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)中關(guān)鍵酶在不同條件下蛋白表達(dá)量的分析125-126
• 6.4 討論126-128
• 全文總結(jié)128-132
• 參考文獻(xiàn)132-146
• 附錄A146-148
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果148-149
• 致謝149-150

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 趙，

本文編號(hào)：846402