本文關(guān)鍵詞：大葉落地生根胎生苗差減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及相關(guān)基因的克隆

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【摘要】：大葉落地生根(K. daigremontiana)別名花蝴蝶、倒吊蓮、大還魂,是景天科(Crassulaceae)伽藍(lán)菜屬(Kalanchoe adans.)中一種極易栽培的觀賞植物。大葉落地生根的胎生苗無(wú)性繁殖過(guò)程,同時(shí)具有胚胎發(fā)生途徑和器官發(fā)生途徑的特點(diǎn),由于其不形成種子,而在葉片邊緣形成體細(xì)胞胚,為研究體細(xì)胞胚發(fā)生途徑、器官發(fā)生途徑和植物體細(xì)胞全能性提供了一個(gè)良好的模型。因此,本研究以大葉落地生根胎生苗為研究對(duì)象,揭示無(wú)性繁殖過(guò)程中相關(guān)基因的的變化,為進(jìn)一步闡明大葉落地生根胎生苗無(wú)性繁殖的過(guò)程提供一個(gè)框架和平臺(tái),對(duì)深入了解無(wú)性繁殖的分子機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。具體的研究結(jié)果如下：1.通過(guò)外施植物激素的方法來(lái)確定生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素在胎生苗發(fā)生和發(fā)育中的作用。胎生苗是發(fā)生在母葉邊緣鋸齒處2-3 mm范圍內(nèi)的細(xì)胞層中,從葉片頂端向葉柄基部逐漸發(fā)生,而且沿著葉片中軸對(duì)稱產(chǎn)生。生長(zhǎng)素(2,4-D)對(duì)胎生苗無(wú)性繁殖的影響較小,起關(guān)鍵作用的激素是細(xì)胞分裂素(6-BA),用細(xì)胞分裂素抑制劑(PR)完全抑制在切割葉片中胎生苗的產(chǎn)生。而且在發(fā)育階段,細(xì)胞分裂素處理過(guò)的胎生苗葉片直徑明顯大于對(duì)照和其他處理。2.通過(guò)SSH技術(shù)來(lái)尋找差異表達(dá)的功能基因,以著生胎生苗的母葉為測(cè)試方(tester),不著生胎生苗的母葉為驅(qū)動(dòng)方(driver),構(gòu)建大葉落地生根胎生苗差減文庫(kù),共富集到481條高質(zhì)量的序列,拼接成390條一致性序列,包括338條單一序列和52條重疊群序列。有132條序列能夠在COG數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)到,分為12個(gè)大類。挑選30條基因進(jìn)行real-time PCR實(shí)驗(yàn),根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將這些分為5類,說(shuō)明在胎生苗發(fā)生發(fā)育過(guò)程中的基因表達(dá)模式非常復(fù)雜,同時(shí)也證明無(wú)性繁殖是一個(gè)復(fù)雜的基因調(diào)控系統(tǒng),涉及到大量基因的表達(dá)水平的變化。3.對(duì)差減文庫(kù)中的6條基因進(jìn)行克隆和分析,包括：組氨醇脫氫酶(KdHDH)、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(KdGST)、F-Box家族蛋白(KdF-box)、S-腺苷高半胱氨酸水解酶(KdSAHH)、谷氨酸脫羧酶(KdGAD)、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(KdCDK)。通過(guò)RACE-PCR技術(shù),獲得這6個(gè)基因的全長(zhǎng)。生物信息學(xué)結(jié)果分析,6個(gè)蛋白都沒(méi)有信號(hào)肽,推測(cè)它們都不是分泌蛋白,說(shuō)明這6個(gè)蛋白在細(xì)胞內(nèi)起作用。其中,KdSAHH、KdF-box、KdCDK、KdGAD、KdGST是親水性蛋白,KdHDH是疏水性蛋白。KdSAHH、KdF-box、KdCDK、KdGAD、KdHDH是酸性蛋白質(zhì),KdGST是堿性蛋白質(zhì)。其中,大葉落地生根KdHDH基因ORF長(zhǎng)為1452 bp,編碼483個(gè)氨基酸,具有明顯的疏水區(qū)域和跨膜結(jié)構(gòu),LOCTree軟件預(yù)測(cè)定位在葉綠體膜上,與咪唑甘油磷酸脫水酶存在相互作用。大葉落地生根KdGST基因ORF長(zhǎng)為1272 bp,編碼423個(gè)氨基酸,是一個(gè)親水性蛋白,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。大葉落地生根KdGAD基因ORF長(zhǎng)為1509 bp,編碼502個(gè)氨基酸,分子大小為56.57 kD。沒(méi)有明顯的疏水區(qū)域和跨膜結(jié)構(gòu)。LOCTree軟件預(yù)測(cè)該蛋白定位在細(xì)胞核上。大葉落地生根KdCDK基因ORF長(zhǎng)為888 bp,編碼295個(gè)氨基酸,是一個(gè)親水性蛋白,沒(méi)有明顯的跨膜區(qū)域,可能定位在細(xì)胞質(zhì)中。大葉落地生根KdF-box基因ORF長(zhǎng)為987 bp,編碼328個(gè)氨基酸,是親水性蛋白,沒(méi)有明顯的跨膜結(jié)構(gòu),定位在細(xì)胞質(zhì)中,是非分泌蛋白。大葉落地生根KdSAHH基因ORF長(zhǎng)1458 bp,編碼485個(gè)氨基酸。沒(méi)有明顯的疏水區(qū)域和跨膜結(jié)構(gòu),是一個(gè)親水性蛋白質(zhì),定位與細(xì)胞質(zhì)中,屬于非分泌蛋白。4. KdSAHH基因在胎生苗無(wú)性繁殖過(guò)程中上調(diào)表達(dá),差異表達(dá)量達(dá)到4.08倍,該基因無(wú)信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域,說(shuō)明KdSAHH蛋白是一個(gè)廣譜表達(dá)而非膜定位的蛋白,與甲基轉(zhuǎn)移酶基因有相互作用,其它有相互作用的蛋白也都與甲基轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此,選擇KdSAHH基因進(jìn)行深入研究。成功構(gòu)建KdSAHH基因的超表達(dá)載體、RNAi載體并轉(zhuǎn)化大葉落地生根和煙草,獲得轉(zhuǎn)化植株。綜上所述,本研究在轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)大葉落地生根胎生苗無(wú)性繁殖過(guò)程進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)大量與無(wú)性繁殖相關(guān)的基因,通過(guò)real-time PCR分析了30個(gè)基因的表達(dá)模式,通過(guò)RACE-PCR克隆出其中6個(gè)基因的全長(zhǎng),并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,選擇KdSAHH基因進(jìn)行下一步研究,構(gòu)建KdSAHH基因的超表達(dá)載體、RNAi載體轉(zhuǎn)化大葉落地生根和煙草,并成功獲得轉(zhuǎn)化植株。本研究的發(fā)現(xiàn)為解釋大葉落地生根胎生苗無(wú)性繁殖的分子機(jī)制提供了基因資源和工作平臺(tái),充實(shí)了大葉落地生根的研究資源,是對(duì)大葉落地生根處于初級(jí)研究階段的填補(bǔ)和充實(shí)。
【關(guān)鍵詞】：大葉落地生根 胎生苗 差減雜交 基因克隆 KdSAHH基因
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S682.36
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 縮略詞9-11
• 目錄11-15
• 1 引言15-17
• 2 文獻(xiàn)綜述17-28
• 2.1 大葉落地生根的概況17-19
• 2.1.1 大葉落地生根的來(lái)源17-18
• 2.1.2 大葉落地生根的形態(tài)特征18-19
• 2.1.3 大葉落地生根的栽培繁殖管理19
• 2.2 伽藍(lán)菜屬的分類情況19-20
• 2.3 大葉落地生根的研究?jī)r(jià)值20-22
• 2.3.1 觀賞價(jià)值20
• 2.3.2 經(jīng)濟(jì)價(jià)值20
• 2.3.3 教學(xué)價(jià)值20-21
• 2.3.4 景天酸代謝(CAM)研究模型21
• 2.3.5 藥用價(jià)值21-22
• 2.3.6 抗病蟲(chóng)價(jià)值22
• 2.4 胎生苗模型研究?jī)r(jià)值22-25
• 2.4.1 胚胎發(fā)生途徑的特征23-24
• 2.4.2 器官發(fā)生途徑的特征24
• 2.4.3 胎生苗發(fā)生發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)和基因功能24-25
• 2.5 本研究的目的和內(nèi)容25-28
• 2.5.1 研究的目的意義25-26
• 2.5.2 研究?jī)?nèi)容26
• 2.5.3 技術(shù)路線26-28
• 3 生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素在大葉落地生根胎生苗發(fā)生發(fā)育過(guò)程中的作用28-41
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理28-30
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料28
• 3.1.2 植物激素的配置28-29
• 3.1.3 試驗(yàn)處理29
• 3.1.4 確定胎生苗發(fā)生位置29-30
• 3.1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)30
• 3.2 結(jié)果與分析30-38
• 3.2.1 胎生苗發(fā)生位置30-31
• 3.2.2 不同激素處理誘導(dǎo)產(chǎn)生的胎生苗的表型差異31-33
• 3.2.3 以完整葉片作為外植體在不同激素處理下誘導(dǎo)產(chǎn)生胎生苗的時(shí)間和數(shù)量差異33-35
• 3.2.4 以切割葉片作為外植體在不同激素處理下誘導(dǎo)產(chǎn)生胎生苗的時(shí)間和數(shù)量差異35-37
• 3.2.5 不同激素處理對(duì)胎生苗發(fā)育的影響37-38
• 3.3 討論38-39
• 3.4 小結(jié)39-41
• 4 大葉落地生根胎生苗差減文庫(kù)的構(gòu)建及差異基因的表達(dá)分析41-63
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理42-44
• 4.1.1 植物材料42
• 4.1.2 主要酶與試劑42
• 4.1.3 主要儀器設(shè)備42-43
• 4.1.4 常用培養(yǎng)基43
• 4.1.5 Real-time PCR引物的設(shè)計(jì)43-44
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法44-46
• 4.2.1 總RNA的提取44
• 4.2.2 mRNA的分離純化44
• 4.2.3 cDNA的合成和RsaI的酶切44
• 4.2.4 SSH差減文庫(kù)的構(gòu)建44-45
• 4.2.5 測(cè)序和生物信息學(xué)分析45
• 4.2.6 熒光定量PCR分析差異基因的表達(dá)45-46
• 4.3 結(jié)果與分析46-59
• 4.3.1 葉片總RNA的完整性及mRNA分離純化46-47
• 4.3.2 最佳循環(huán)數(shù)的優(yōu)化47-48
• 4.3.3 cDNA的純化48-49
• 4.3.4 RsaⅠ酶切后純化效率檢測(cè)49-50
• 4.3.5 抑制性差減雜交效率分析50-51
• 4.3.6 差減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及陽(yáng)性克隆的篩選51-52
• 4.3.7 差減文庫(kù)的的序列分析52-56
• 4.3.8 差異基因的表達(dá)分析56-59
• 4.4 討論59-62
• 4.4.1 葉片總RNA及mRNA的分離純化59-60
• 4.4.2 差減cDNA文庫(kù)的可靠性60-61
• 4.4.3 胎生苗無(wú)性繁殖過(guò)程中涉及到的基因61-62
• 4.5 小結(jié)62-63
• 5 胎生苗無(wú)性繁殖中相關(guān)基因的克隆和生物信息學(xué)分析63-106
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理63-64
• 5.1.1 植物材料63
• 5.1.2 主要酶與試劑63-64
• 5.1.3 主要儀器設(shè)備64
• 5.1.4 常用培養(yǎng)基64
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法64-80
• 5.2.1 總RNA的提取64
• 5.2.2 組氨醇脫氫酶(histidinol dehydrogenase；KdHDH)基因的克隆64-71
• 5.2.3 谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase；KdGST)基因的克隆71-72
• 5.2.4 谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase;KdGAD)基因的克隆72-73
• 5.2.5 細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin dependent kinase；KdCDK)基因的克隆73-74
• 5.2.6 F-Box家族蛋白(F-box family protein；KdF-box)基因的克隆74-75
• 5.2.7 S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocystrine hydrolase:KdSAHH)基因的克隆75-79
• 5.2.8 獲得序列的生物信息學(xué)分析79-80
• 5.3 結(jié)果與分析80-104
• 5.3.1 組氨醇脫氫酶(KdHDH)基因克隆與生物信息學(xué)分析80-84
• 5.3.2 谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(KdGST)基因克隆與生物信息學(xué)分析84-88
• 5.3.3 谷氨酸脫羧酶(KdGAD)基因克隆與生物信息學(xué)分析88-92
• 5.3.4 細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(KdCDK)基因克隆與生物信息學(xué)分析92-96
• 5.3.5 F-Box家族蛋白(KdF-box)基因克隆與生物信息學(xué)分析96-100
• 5.3.6 S-腺苷高半胱氨酸水解酶(KdSAHH)基因克隆與生物信息學(xué)分析100-104
• 5.4 討論104-105
• 5.5 小結(jié)105-106
• 6 大葉落地生根KdSAHH基因?qū)煵莺痛笕~落地生根的轉(zhuǎn)化106-124
• 6.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理107-108
• 6.1.1 植物材料107
• 6.1.2 主要酶與試劑107
• 6.1.3 植物表達(dá)載體107
• 6.1.4 主要設(shè)備107
• 6.1.5 主要培養(yǎng)基107-108
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法108-117
• 6.2.1 KdSAHH基因超表達(dá)載體的構(gòu)建108-111
• 6.2.2 KdSAHH基因全長(zhǎng)RNAi載體的構(gòu)建111-116
• 6.2.3 KdSAHH基因保守區(qū)RNAi載體的構(gòu)建116
• 6.2.4 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化鑒定116
• 6.2.5 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大葉落地生根116-117
• 6.2.6 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草117
• 6.3 結(jié)果與分析117-122
• 6.3.1 尤基因超表達(dá)載體的構(gòu)建117-118
• 6.3.2 基因全長(zhǎng)RNAi載體的構(gòu)建118-119
• 6.3.3 足基因保守區(qū)RNAi載體的構(gòu)建119-120
• 6.3.4 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大葉落地生根120-121
• 6.3.5 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草121-122
• 6.4 討論122-123
• 6.5 小結(jié)123-124
• 7 結(jié)論與展望124-127
• 7.1 結(jié)論124
• 7.2 創(chuàng)新點(diǎn)124-125
• 7.3 展望125-127
• 參考文獻(xiàn)127-135
• 附圖135-136
• 個(gè)人簡(jiǎn)介136-137
• 獲得成果目錄137-138
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介138-139
• 致謝139-14

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