本文關(guān)鍵詞：水禽與哺乳類RIG-I抗流感病毒功能比較研究

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【摘要】：維甲酸誘導(dǎo)基因I (retinoic acid-inducible gene I, RIG-I),是一類胞質(zhì)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs),它能夠識(shí)別RNA病毒的ssRNA或病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的dsRNA,并啟動(dòng)Ⅰ型干擾素相關(guān)抗病毒先天性免疫反應(yīng)。 RIG-I蛋白序列生物信息學(xué)分析顯示,鳥類RIG-I與爬行類親緣關(guān)系較近,但與哺乳類較遠(yuǎn)。RIG-I磷酸化位點(diǎn)和泛素化位點(diǎn)數(shù)量在魚類-爬行類-哺乳類進(jìn)化軸上逐漸增加,但泛素化位點(diǎn)數(shù)量在魚類-爬行類-鳥類進(jìn)化軸上先增加后減少。這說明RIG-I在爬行類向哺乳類和鳥類進(jìn)化過程中,調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜化程度出現(xiàn)了較大差異。 水禽(鴨子和鵝)與哺乳類(人和小鼠)RIG-I表達(dá)量和亞細(xì)胞定位顯示,水禽RIG-Ⅰ及其CARDs (Caspase recuriment domains, CARDs)表達(dá)量顯著高于哺乳類RIG-Ⅰ和CARDs。密碼子偏好性分析顯示水禽RIG-I在人的表達(dá)系統(tǒng)中適應(yīng)性高于人和小鼠RIG-I,而稀有密碼子數(shù)則少于人和小鼠RIG-I,這可能是人和小鼠RIG-I表達(dá)量較低的原因。 水禽與哺乳類RIG-I抗流感病毒能力比較顯示,鴨子和鵝RIG-I/CARDs在雞的細(xì)胞中可顯著性增強(qiáng)IFN-β, Mx, PKR表達(dá)量,并抑制流感病毒復(fù)制,但人和小鼠RIG-I/CARDs在雞的細(xì)胞中則無法行使其抗病毒功能。相反,人和小鼠RIG-I/CARDs在人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中可顯著性上調(diào)IFN-β,Mx,PKR等抗病毒基因表達(dá)并抑制流感病毒復(fù)制。但鴨RIG-I及其CARDs在A549細(xì)胞中作用較弱,鵝RIG-I反而抑制干擾素表達(dá)。以上結(jié)果說明RIG-I只能在親緣關(guān)系較近的物種中發(fā)揮其抗病毒作用。 為明確鴨子和鵝RIG-I誘導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)能力差異的原因,我們將dCARDs (duckCARDs)與gCARDs (gooseCARDs)的CARD1結(jié)構(gòu)域互換。結(jié)果表明dCARDl替換gCARDs中的gCARDl導(dǎo)致其干擾素誘導(dǎo)能力降低,dCARD2替換gCARDs中的gCARD2導(dǎo)致其干擾素誘導(dǎo)能力增強(qiáng)。這說明CARD1上部分氨基酸位點(diǎn)差異導(dǎo)致鴨子和鵝RIG-Ⅰ干擾素誘導(dǎo)能力不同。點(diǎn)突變證實(shí)dCARDs第8位絲氨酸負(fù)調(diào)控其干擾素誘導(dǎo)。因此我們認(rèn)為鵝RIG-Ⅰ第8位缺少絲氨酸可能使其不受到磷酸化負(fù)調(diào)控,從而對(duì)干擾素誘導(dǎo)能力更強(qiáng)。 為驗(yàn)證dRIG-Ⅰ是否在鴨胚胎成纖維細(xì)胞(DEF)識(shí)別流感病毒過程中起關(guān)鍵作用,我們利用siRNA干擾DEF細(xì)胞中RIG-Ⅰ基因的表達(dá)。結(jié)果顯示RIG-Ⅰ表達(dá)量的降低導(dǎo)致ZB07病毒M基因表達(dá)上調(diào),干擾素表達(dá)顯著性降低。這說明DEF能夠利用RIG-Ⅰ識(shí)別流感病毒,進(jìn)而誘導(dǎo)抗病毒先天性免疫反應(yīng)。為驗(yàn)證dRIG-Ⅰ能否為RIG-Ⅰ天然缺失的雞DF-1細(xì)胞提供抗病毒保護(hù)作用,我們?cè)贒F-1細(xì)胞中進(jìn)行dRIG-Ⅰ過表達(dá)和禽流感病毒ZB07感染。結(jié)果顯示RIG-Ⅰ可抑制ZB07病毒誘導(dǎo)的雞DF-1細(xì)胞凋亡,減少細(xì)胞病變。以上結(jié)果暗示鴨子RIG-Ⅰ在鴨子識(shí)別禽流感病毒中起至關(guān)重要的作用,并且可以作為改善雞對(duì)流感病毒敏感性的備選基因。 綜上所述,本研究揭示了脊椎動(dòng)物RIG-Ⅰ的進(jìn)化規(guī)律,水禽與哺乳類RIG-Ⅰ之間功能差異,以及鴨子RIG-Ⅰ在識(shí)別流感病毒過程中的作用。這些研究結(jié)果為禽類RIG-Ⅰ抗流感功能的進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：RIG-I 流感病毒 干擾素 水禽 哺乳類
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• ~.略詞表9-10
• 第一章 引言10-24
• 1.1 天然免疫10
• 1.2 模式識(shí)別受體10-11
• 1.3 TLRs11-13
• 1.3.1 TLRs的分布11
• 1.3.2 TLRs識(shí)別的配體11-12
• 1.3.3 TLRs介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)12-13
• 1.4 NLRs13-14
• 1.4.1 NLRs識(shí)別的配體13
• 1.4.2 NLRs介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)13-14
• 1.5 RLRs14-19
• 1.5.1 RLRs識(shí)別配體14-15
• 1.5.2 RIG-Ⅰ分子結(jié)構(gòu)15-17
• 1.5.3 RLRs介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)17
• 1.5.4 RIG-Ⅰ磷酸化與泛素化修飾17-19
• 1.5.5 病原體拮抗RIG-Ⅰ信號(hào)通路19
• 1.6 流感病毒19-23
• 1.6.1 流感病毒宿主范圍與分類20
• 1.6.2 基因組及其編碼蛋白20-22
• 1.6.3 流感病毒復(fù)制過程22-23
• 1.7 研究目的與意義23-24
• 第二章 材料與方法24-44
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料24-27
• 2.1.1 質(zhì)粒與菌株24
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與雞胚24
• 2.1.3 病毒與細(xì)胞系24
• 2.1.4 試劑及試劑盒24-25
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器25
• 2.1.6 主要試劑配制25-27
• 2.1.7 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析相關(guān)軟件27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法27-44
• 2.2.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備27
• 2.2.2 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化27-28
• 2.2.3 質(zhì)粒提取28-29
• 2.2.4 質(zhì)粒酶切29-30
• 2.2.5 DNA回收30
• 2.2.6 目的片段與載體的重組30-31
• 2.2.7 RNA提取31-32
• 2.2.8 RT-PCR32
• 2.2.9 PCR反應(yīng)32-38
• 2.2.10 Western Blot38-39
• 2.2.11 細(xì)胞培養(yǎng)39-41
• 2.2.12 AnnexinV/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡41
• 2.2.13 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞定位41-42
• 2.2.14 病毒增殖42
• 2.2.15 紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)42
• 2.2.16 熒光半數(shù)組織感染量(TCID50)的測定42-43
• 2.2.17 引物合成與測序43
• 2.2.18 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析與圖片處理43-44
• 第三章 結(jié)果與分析44-75
• 3.1 RIG-Ⅰ生物信息學(xué)分析44-51
• 3.1.1 RIG-Ⅰ蛋白序列進(jìn)化分析44-46
• 3.1.2 RIG-Ⅰ蛋白序列修飾位點(diǎn)差異分析46-51
• 3.2 水禽與哺乳類來源RIG-Ⅰ細(xì)胞表達(dá)與定位比較51-58
• 3.2.1 鴨、人和小鼠RIG-Ⅰ cDNA的克隆51
• 3.2.2 RIG-Ⅰ基因測序鑒定51
• 3.2.3 鴨、鵝、人和小鼠RIG-Ⅰ兩端加同源臂51-52
• 3.2.4 重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定52-53
• 3.2.5 質(zhì)粒電泳與測序鑒定53-54
• 3.2.6 四種RIG-Ⅰ和CARDs在DF-1細(xì)胞中表達(dá)量差異比較54-55
• 3.2.7 四種RIG-Ⅰ和CARDs在293T細(xì)胞中表達(dá)量差異比較55-56
• 3.2.8 RIG-Ⅰ密碼子偏好性分析56-57
• 3.2.9 四種RIG-Ⅰ和CARDs在DF-1細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位比較57-58
• 3.2.10 四種RIG-Ⅰ和CARDs在293T細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位比較58
• 3.3 水禽與哺乳類來源RIG-Ⅰ抗流感病毒能力比較58-66
• 3.3.1 水禽RIG-Ⅰ在DF-1細(xì)胞中抗病毒基因誘導(dǎo)能力高于哺乳類RIG-Ⅰ59-61
• 3.3.2 哺乳類RIG-Ⅰ在293T細(xì)胞中抗病毒基因誘導(dǎo)能力高于水禽RIG-Ⅰ61-62
• 3.3.3 哺乳類RIG-Ⅰ在A549細(xì)胞中抗病毒基因誘導(dǎo)能力高于水禽RIG-Ⅰ62-63
• 3.3.4 水禽RIG-Ⅰ在DF-1細(xì)胞中抑制流感病毒復(fù)制能力高于哺乳類RIG-Ⅰ63-64
• 3.3.5 哺乳類RIG-Ⅰ在A549細(xì)胞中抑制流感病毒復(fù)制能力高于水禽RIG-Ⅰ64-65
• 3.3.6 哺乳類RIG-Ⅰ在MDCK細(xì)胞中抑制流感病毒復(fù)制能力高于水禽RIG-Ⅰ65-66
• 3.4 鴨和鵝RIG-Ⅰ干擾素誘導(dǎo)差異機(jī)制66-72
• 3.4.1 CARDs替換對(duì)RIG-Ⅰ表達(dá)量和細(xì)胞定位影響67-68
• 3.4.2 重組CARDs/RIG-Ⅰ在DF-1中表達(dá)量差異比較68-69
• 3.4.3 重組CARDs/RIG-Ⅰ在293T中表達(dá)量差異比較69-70
• 3.4.4 鴨和鵝RIG-Ⅰ CARDs結(jié)構(gòu)域交換導(dǎo)致RIG-Ⅰ超激活70-71
• 3.4.5 Ser8磷酸化負(fù)調(diào)控dCARDs干擾素激活71-72
• 3.5 鴨RIG-Ⅰ在鴨和雞細(xì)胞中識(shí)別流感病毒并誘導(dǎo)抗病毒反應(yīng)72-75
• 3.5.1 DEF中干擾dRIG-Ⅰ抑制IFN-β表達(dá),促進(jìn)流感病毒復(fù)制73
• 3.5.2 DF-1細(xì)胞中過表達(dá)dRIG-Ⅰ抑制禽流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡73-75
• 第四章 討論與展望75-80
• 4.1 鳥類與哺乳類RIG-Ⅰ進(jìn)化關(guān)系存在較大差異75
• 4.2 水禽RIG-Ⅰ表達(dá)量高于哺乳動(dòng)物來源RIG-Ⅰ75
• 4.3 水禽與哺乳類RIG-Ⅰ細(xì)胞定位類似75-76
• 4.4 水禽與哺乳類來源RIG-Ⅰ基因只在親緣關(guān)系較近的宿主中發(fā)揮作用76-77
• 4.5 鴨和鵝RIG-Ⅰ結(jié)構(gòu)域重組導(dǎo)致其持續(xù)激活77-78
• 4.6 鴨胚胎成纖維細(xì)胞利用RIG-Ⅰ識(shí)別禽流感病毒78
• 4.7 dRIG-Ⅰ為雞成纖維細(xì)胞提供保護(hù)作用78-79
• 4.8 結(jié)論與展望79-80
• 4.8.1 結(jié)論79
• 4.8.2 展望79-80
• 參考文獻(xiàn)80-92
• 致謝92-93
• 附錄93-102
• 個(gè)人簡歷102

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 余華;;豬流感病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年S1期

2 王彥輝;鄭明學(xué);;禽流感病毒基因組編碼的蛋白及功能[J];國外畜牧學(xué)(豬與禽);2007年02期

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本文編號(hào)：781725