本文關(guān)鍵詞：牙鲆（Paralichthys olivaceus）dazl基因的克隆、表達(dá)和功能初步研究

  更多相關(guān)文章： 牙鲆 生殖細(xì)胞 daz1 可變剪接 表達(dá) 靶mRNA

【摘要】：近年來,關(guān)于生殖細(xì)胞的研究被全世界學(xué)者廣泛關(guān)注,除在哺乳動(dòng)物中有廣泛深入的研究以外,在魚類等低等脊椎動(dòng)物中也逐漸開展起來,并取得很多進(jìn)展。DAZL (deleted in azoospermia-like)是DAZ家族的成員之一,同時(shí)也是一種重要的RNA結(jié)合蛋白�，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),從無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物,dazl特異地表達(dá)于雌性和雄性生殖細(xì)胞,可能在生殖細(xì)胞發(fā)育過程發(fā)揮重要作用。不少研究也從一些硬骨魚中鑒定了dazl基因,并對(duì)其表達(dá)規(guī)律作出了詳細(xì)的探討。本研究克隆和鑒定了牙鲆(Paralichthys olivaceus) dazl基因,首次在硬骨魚中發(fā)現(xiàn)了其mRNA的可變剪接形式,將這兩種牙鲆dazl mRNA稱為Podazl-Ⅰ和Podazl-Ⅱ,探究了它們?cè)趍RNA水平和蛋白水平的表達(dá)規(guī)律,并找到了牙鲆DAZL的靶mRNA,預(yù)測(cè)其功能。首先,通過基因克隆等方法,得到了牙鲆dazl基因,全長(zhǎng)5413 bp,包括9個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子,其中外顯子1僅有ATG三個(gè)堿基,內(nèi)含子9位于3’非翻譯區(qū),這些特征與許多dazl同源基因是相似的。一對(duì)dazl等位基因在內(nèi)含子6的序列上有差異。由于外顯子8在轉(zhuǎn)錄或修飾時(shí)被刪除,導(dǎo)致牙鲆dazl會(huì)產(chǎn)生一種較短的mRNA,與完整的轉(zhuǎn)錄本相比,缺失外顯子8對(duì)應(yīng)的51 nt。 DAZL同源多肽序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在RNA識(shí)別基序(RRM)中,有7個(gè)氨基酸位點(diǎn)可以將硬骨魚和其它物種區(qū)分開來。牙鲆DAZL兩種多肽序列與尖吻鱸DAZL序列的一致度最高,達(dá)到80.6%和80.4%。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)到GATA、CEBP和SOX等轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控牙鲆dazl的轉(zhuǎn)錄。然后,通過反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)定量PCR,驗(yàn)證了Podazl-Ⅰ和Podazl-Ⅱ都特異地表達(dá)于牙鲆的精巢和卵巢,以及胚胎發(fā)育的主要時(shí)期,且Podazl-Ⅱ較Podazl-Ⅰ的表達(dá)量略高,兩者在卵巢的表達(dá)水平都明顯高于精巢,在胚胎發(fā)育到原腸中期之前的表達(dá)量較高,之后的時(shí)期表達(dá)水平很低,僅在出膜前有瞬時(shí)的升高。通過組織切片原位雜交、western blot和免疫組織化學(xué)等方法,證明Podazl-Ⅰ和Podazl-Ⅱ主要定位于雌性和雄性生殖細(xì)胞,兩者對(duì)應(yīng)的蛋白產(chǎn)物也具有性腺特異的表達(dá)模式,同樣集中表達(dá)于生殖細(xì)胞。預(yù)測(cè)到牙鲆dazl基因上游可能有兩個(gè)CpG島,通過亞硫酸鹽處理和測(cè)序,并未發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)CpG島的甲基化水平在性腺和非性腺組織有明顯差異,可能甲基化并不是調(diào)控牙鲆dazl表達(dá)的主要方式。最后,通過RNA-蛋白免疫共沉淀和高通量測(cè)序方法,研究牙鲆卵巢中DAZL兩種蛋白可能的靶mRNA。對(duì)測(cè)序結(jié)果的注釋的分析共找到3334個(gè)可能直接或間接受到牙鲆DAZL調(diào)控的mRNA,牙鲆DAZL對(duì)組成核小體核心的組蛋白mRNA富集量最高,說明它可能參與組蛋白mRNA的處理和修飾。從靶mRNA中也找到一些與生長(zhǎng)、發(fā)育和生殖相關(guān)的因子,如oct4、gata6、vasa、dazl和dnd等,提示牙鲆DAZL能夠調(diào)控這些重要的生物過程。GO注釋和KEGG信號(hào)通路分析,均預(yù)測(cè)牙鲆DAZL可以參與RNA處理和代謝、翻譯調(diào)控、細(xì)胞周期、蛋白代謝等多種生物過程。對(duì)PODAZL-Ⅰ和PODAZL-Ⅱ的差異靶mRNA分析,并沒有發(fā)現(xiàn)牙鲆兩種DAZL具有明顯的功能差異。最后,通過qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了兩組免疫沉淀樣品中都富集了Podazl-Ⅰ和Podazl-Ⅱ,說明牙鲆DAZL可能直接或間接調(diào)控其自身mRNA.本研究對(duì)牙鲆dazl兩種mRNA和蛋白的鑒定、表達(dá)規(guī)律分析和靶mRNA分析,證明了牙鲆dazl可以作為生殖細(xì)胞標(biāo)記因子應(yīng)用到今后的相關(guān)研究中。牙鲆dazl兩種mRNA和蛋白形式的表達(dá)規(guī)律比較及靶mRNA比較結(jié)果說明,兩者在功能上可能不存在明顯差異,或許牙鲆dazl較短的可變剪接形式的出現(xiàn)可以更高效的進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯,與完整的剪接形式一起,共同執(zhí)行相似的生物學(xué)功能。這些結(jié)果為牙鲆及其它硬骨魚的生殖和發(fā)育研究提供重要的參考依據(jù),為種質(zhì)資源的利用和保存、育種工作的開展奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：牙鲆 生殖細(xì)胞 daz1 可變剪接 表達(dá) 靶mRNA
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-32
• 1.1 引言12
• 1.2 魚類生殖細(xì)胞發(fā)育12-17
• 1.2.1 魚類的性別決定及相關(guān)因子12-14
• 1.2.2 魚類生殖細(xì)胞發(fā)育及相關(guān)因子14-16
• 1.2.3 魚類生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因16-17
• 1.3 RNA結(jié)合蛋白17-20
• 1.3.1 RNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)特征17-19
• 1.3.2 RNA結(jié)合蛋白的功能19-20
• 1.4 DAZ家族研究進(jìn)展20-27
• 1.4.1 DAZ家族的結(jié)構(gòu)特征20-21
• 1.4.2 DAZ家族成員的進(jìn)化關(guān)系21
• 1.4.3 DAZ家族的相關(guān)研究21-26
• 1.4.4 DAZ家族與人類疾病26-27
• 1.5 硬骨魚dazl表達(dá)與功能研究27-28
• 1.6 本研究的主要內(nèi)容和意義28-32
• 1.6.1 本研究的主要內(nèi)容28-30
• 1.6.2 本研究的創(chuàng)新性和意義30-32
• 第二章 牙鲆dazl基因及其可變剪接mRNA的鑒定32-57
• 2.1 引言32
• 2.2 材料與方法32-34
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料32
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法32-34
• 2.3 結(jié)果34-53
• 2.3.1 牙鲆dazl cDNA序列34-39
• 2.3.2 牙鲆dazl DNA序列39-44
• 2.3.3 牙鲆dazl兩種可變剪接mRNA的鑒定44-51
• 2.3.4 牙鲆dazl基因上游調(diào)控序列的預(yù)測(cè)51-53
• 2.4 討論53-57
• 2.4.1 關(guān)于實(shí)驗(yàn)方法53-54
• 2.4.2 關(guān)于牙鲆dazl UTR的可變剪接54-55
• 2.4.3 關(guān)于牙鲆dazl可變剪接的意義55-56
• 2.4.4 本章小結(jié)56-57
• 第三章 牙鲆DAZL的表達(dá)規(guī)律57-80
• 3.1 引言57
• 3.2 材料與方法57-63
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料57
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法57-63
• 3.3 結(jié)果63-77
• 3.3.1 牙鲆dazl mRNA在各組織的相對(duì)表達(dá)水平63-64
• 3.3.2 牙鲆dazl兩種mRNA在性腺的表達(dá)64
• 3.3.3 牙鲆dazl兩種mRNA在胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)64-66
• 3.3.4 牙鲆dazl兩種mRNA在性腺的定位66-69
• 3.3.5 牙鲆dazl甲基化對(duì)其表達(dá)的調(diào)控69-72
• 3.3.6 牙鲆DAZL兩種蛋白在組織的表達(dá)72-75
• 3.3.7 牙鲆DAZL兩種蛋白在性腺的定位75-77
• 3.4 討論77-80
• 3.4.1 關(guān)于實(shí)驗(yàn)方法77
• 3.4.2 關(guān)于牙鲆dazl mRNA與蛋白的表達(dá)77-79
• 3.4.3 本章小結(jié)79-80
• 第四章 牙鲆DAZL兩種蛋白的靶mRNA研究80-108
• 4.1 引言80
• 4.2 材料與方法80-85
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料80
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法80-85
• 4.3 結(jié)果85-104
• 4.3.1 免疫沉淀產(chǎn)物的RT-PCR檢測(cè)85-88
• 4.3.2 高通量測(cè)序結(jié)果88-89
• 4.3.3 牙鲆DAZL兩種蛋白的靶mRNA89-102
• 4.3.4 牙鲆dazl的兩種mRNA可能是其蛋白產(chǎn)物的靶mRNA102-104
• 4.4 討論104-106
• 4.4.1 關(guān)于實(shí)驗(yàn)方法104-105
• 4.4.2 關(guān)于PODAZL的功能105
• 4.4.3 本章小結(jié)105-106
• 4.5 總結(jié)與展望106-108
• 參考文獻(xiàn)108-123
• 致謝123-124
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷124
• 發(fā)表的學(xué)術(shù)論文124

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本文編號(hào)：634450