本文關(guān)鍵詞：IBV感染雞腎臟和脾臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析及雞IFITM1抑制IBV和NDV復(fù)制機(jī)制的研究

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【摘要】：雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)和新城疫病毒(NDV)是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要病原,二者引起急性、高度傳染性禽呼吸道疾病,威脅著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了IBV感染后宿主脾臟和腎臟中全基因的差異表達(dá)情況,借以嘗試揭示IBV的致病機(jī)制和宿主的抗病毒機(jī)制。我們比較分析了IBV感染早期和晚期脾臟基因差異表達(dá)情況。結(jié)果表明脾臟作為重要免疫器官參與了宿主對(duì)IBV的免疫反應(yīng),在IBV感染早期激發(fā)的免疫反應(yīng)要強(qiáng)于感染晚期,IBV感染晚期誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)要強(qiáng)于感染早期。在IBV感染致死雞的腎臟中共有1777個(gè)差異表達(dá)基因;其中包括干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白1(IFITM1)在內(nèi)的103個(gè)免疫和炎癥相關(guān)基因顯著差異表達(dá)這103個(gè)免疫和炎癥相關(guān)基因能夠組成一個(gè)以IL6,STAT1,MYD88,IRF1和NFKB2為中心的相互作用網(wǎng)絡(luò)。提示這些基因可能在宿主抵抗IBV感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示差異表達(dá)基因主要參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞粘附、能量代謝、細(xì)胞因子通路、免疫反應(yīng)、凋亡調(diào)節(jié)等生物進(jìn)程。我們首次對(duì)IBV感染雞的腎臟和脾臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,研究結(jié)果為進(jìn)一步深入了解宿主的抗病毒機(jī)制和IBV的致病機(jī)制提供了素材。IFITM是一類重要的抗病毒因子,我們?cè)谶M(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)ch IFITM1(LOC422993)在IBV感染的腎臟中顯著上調(diào)表達(dá)。人源和鼠源IFITM蛋白通過(guò)定位在細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)體膜上限制SARS-Co V、流感病毒、登革熱病毒、人類免疫缺陷病毒等多種病毒的侵入,但雞源IFITM1(ch IFITM1)在病毒感染中的潛在作用尚未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Gen Bank中標(biāo)注為IFITM3的基因(LOC422993)含有IFITM家族特有的CD225保守結(jié)構(gòu)域,因此LOC422993屬于IFITM家族;但LOC422993缺失YXX?氨基酸基序,YXX?氨基酸基序的缺失是人源、鼠源、豬源IFITM1蛋白的共性,因此我們認(rèn)為L(zhǎng)OC422993為雞源IFITM1而非IFITM3。通過(guò)熒光定量RT-PCR檢測(cè)ch IFITM1基因的體內(nèi)外分布情況時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因在各組織分布差別很大,腎臟、氣管和肺臟在轉(zhuǎn)錄水平幾乎檢測(cè)不到ch IFITM 1的表達(dá),只有個(gè)別雞檢測(cè)到低拷貝表達(dá);脾臟、胸腺和腺胃的表達(dá)量也較低,而消化道、法氏囊、肝臟和胰腺的表達(dá)量較高。同時(shí)體外培養(yǎng)的DF1和LMH細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)不到ch IFITM 1的表達(dá);CEF細(xì)胞中有微弱表達(dá),推測(cè)可能是在制備細(xì)胞過(guò)程中腸道等ch IFITM 1高表達(dá)組織未能完全去除所致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在IBV感染致死雞的靶器官氣管和腎臟中ch IFITM1 m RNA顯著上調(diào)表達(dá),其中在腎臟中的上調(diào)倍數(shù)高于氣管中的上調(diào)倍數(shù),ch IFITM1在其它6株IBV分離毒株感染致死雞腎臟組織中同樣上調(diào)表達(dá),證實(shí)不同IBV毒株的感染普遍誘導(dǎo)ch IFITM1上調(diào)表達(dá);鑒于自然狀態(tài)下氣管和腎臟中幾乎檢測(cè)不到ch IFITM1的表達(dá),因此ch IFITM1在IBV靶器官氣管和腎臟中屬于病毒誘導(dǎo)型表達(dá)。同為禽呼吸道病毒的NDV感染24h就能在氣管中誘導(dǎo)ch IFITM1上調(diào)表達(dá),說(shuō)明ch IFITM1較早地參與了機(jī)體抗病毒反應(yīng)。NDV感染致死雞的腎臟、氣管和腺胃中ch IFITM1同樣顯著上調(diào)表達(dá),說(shuō)明IBV和NDV在體內(nèi)誘導(dǎo)ch IFITM1表達(dá)方面具有相似性。體外過(guò)表達(dá)ch IFITM1發(fā)現(xiàn)該蛋白顯著抑制NDV的復(fù)制。為了進(jìn)一步鑒定ch IFITM1發(fā)揮抗病毒作用的區(qū)域,我們通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)ch IFITM1具有N端和C兩個(gè)膜外區(qū),分別缺失N端35個(gè)氨基酸和C端7個(gè)氨基酸,發(fā)現(xiàn)ch IFITM1 C端雖僅有7個(gè)氨基酸,但C端的缺失使得ch IFITM1極大地喪失了抑制NDV復(fù)制的能力。我們通過(guò)激光共聚焦實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與人源IFITM1不同,ch IFITM1蛋白并沒(méi)有定位于細(xì)胞外膜而是位于細(xì)胞漿中,但并沒(méi)有與內(nèi)體標(biāo)志物L(fēng)AMP1共定位。以往的觀點(diǎn)認(rèn)為IFITM蛋白通過(guò)定位在細(xì)胞膜或內(nèi)體膜上阻止病毒侵入從而發(fā)揮抗病毒作用,鑒于ch IFITM1的獨(dú)特定位情況,我們推測(cè)ch IFITM1可能與已報(bào)到的人源和鼠源IFITM蛋白不同,具有獨(dú)特的抗病毒機(jī)制。我們嘗試從蛋白相互作用角度探究ch IFITM1蛋白獨(dú)特的抗病毒機(jī)制,Pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)ch IFITM1能夠與EIF5A1在體外相互作用,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)EIF5A1同樣具有抑制NDV復(fù)制的能力,二者相互作用的原理和抗病毒機(jī)制還有待于進(jìn)一步揭示。本研究首次證實(shí)ch IFITM1蛋白具有抑制病毒復(fù)制的能力,發(fā)現(xiàn)ch IFITM1蛋白特有的抑制病毒復(fù)制機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：雞傳染性支氣管炎病毒 轉(zhuǎn)錄組學(xué) 新城疫病毒 干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白1
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.31
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 英文縮略表15-16
• 第一章 引言16-27
• 1.1 雞傳染性支氣管炎概述16-18
• 1.1.1 雞傳染性支氣管炎病原學(xué)及形態(tài)學(xué)16
• 1.1.2 雞傳染性支氣管炎病毒基因組結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白16-17
• 1.1.3 雞傳染性支氣管炎病毒分子流行病學(xué)17-18
• 1.2 冠狀病毒相關(guān)天然免疫研究進(jìn)展18-22
• 1.2.1 冠狀病毒概述18-19
• 1.2.2 宿主針對(duì)冠狀病毒的天然免疫應(yīng)答19-22
• 1.3 新城疫病毒致病機(jī)制研究進(jìn)展22-24
• 1.3.1 新城疫概述22
• 1.3.2 NDV的生物學(xué)特性22
• 1.3.3 NDV分子致病機(jī)制22-24
• 1.4 干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白的研究進(jìn)展24-26
• 1.4.1 病毒抑制因子—干擾素誘導(dǎo)蛋白24-25
• 1.4.2 IFITM的發(fā)現(xiàn)25
• 1.4.3 IFITM抗病毒研究進(jìn)展25-26
• 1.5 本研究的目的和意義26-27
• 第二章 雞傳染性支氣管炎病毒感染雞腎臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析.27-47
• 2.1 材料和方法28-30
• 2.1.1 病毒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物28
• 2.1.2 主要試劑28
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器及軟件28
• 2.1.4 動(dòng)物感染試驗(yàn)及樣品采集28
• 2.1.5 IBV抗體效價(jià)檢測(cè)28
• 2.1.6 Real-time RT-PCR檢測(cè)腎臟中病毒載量28-29
• 2.1.7 IBV感染雞腎臟組織轉(zhuǎn)錄組分析29
• 2.1.8 數(shù)據(jù)處理29
• 2.1.9 生物信息學(xué)分析29-30
• 2.1.10 熒光定量RT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因30
• 2.2 結(jié)果30-44
• 2.2.1 臨床癥狀及血清抗體檢測(cè)結(jié)果30
• 2.2.2 腎臟中病毒載量30-31
• 2.2.3 IBV感染致死雞腎臟組織轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果31
• 2.2.4 差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析31-43
• 2.2.5 熒光定量RT-PCR驗(yàn)證部分差異表達(dá)基因43-44
• 2.3 討論44-47
• 2.3.1 模式識(shí)別受體的差異表達(dá)情況45
• 2.3.2 IBV感染激活干擾素通路45-46
• 2.3.3 IBV感染激發(fā)炎癥反應(yīng)46
• 2.3.4 細(xì)胞凋亡參與IBV感染過(guò)程46-47
• 第三章 雞傳染性支氣管炎病毒感染雞脾臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析47-62
• 3.1 材料和方法48-52
• 3.1.1 病毒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物48
• 3.1.2 主要試劑48
• 3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器及軟件48
• 3.1.4 動(dòng)物感染試驗(yàn)及樣品采集48-49
• 3.1.5 Real-time RT-PCR檢測(cè)氣管中病毒載量49
• 3.1.6 IBV感染雞脾臟組織轉(zhuǎn)錄組分析49
• 3.1.7 數(shù)據(jù)處理49
• 3.1.8 生物信息學(xué)分析49
• 3.1.9 熒光定量RT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因49-52
• 3.2 結(jié)果52-59
• 3.2.1 檢測(cè)氣管中病毒RNA52
• 3.2.2 IBV感染早期和晚期脾臟組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果52-58
• 3.2.3 差異表達(dá)基因的KEGG通路分析58
• 3.2.4 熒光定量RT-PCR驗(yàn)證部分差異表達(dá)基因58-59
• 3.3 討論59-62
• 第四章 雞干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白1抑制NDV和IBV復(fù)制的研究62-80
• 4.1 材料和方法63-68
• 4.1.1 病毒、菌株、細(xì)胞及質(zhì)粒63
• 4.1.2 SPF雞和雞外周血紅細(xì)胞63
• 4.1.3 主要試劑和儀器63
• 4.1.4 IFITM生物信息學(xué)分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹63-64
• 4.1.5 檢測(cè)chIFITM1 mRNA的體內(nèi)外表達(dá)情況64
• 4.1.6 IBV和NDV感染后靶器官中chIFITM1 mRNA的表達(dá)情況64
• 4.1.7 過(guò)表達(dá)chIFITM對(duì)NDV和IBV復(fù)制的影響64-66
• 4.1.8 chIFITM1蛋白的亞細(xì)胞定位66
• 4.1.9 chIFITM蛋白相互作用研究66-68
• 4.2 結(jié)果68-77
• 4.2.1 chIFITM1的生物信息學(xué)分析68-70
• 4.2.2 chIFITM1體內(nèi)外分布情況70-72
• 4.2.3 chIFITM1抑制NDV和IBV復(fù)制72-74
• 4.2.4 缺失N端和C端對(duì)chIFITM1抗病毒活性的影響74
• 4.2.5 chIFITM1和NDV HN蛋白的亞細(xì)胞定位情況74-75
• 4.2.6 chIFITM1的原核表達(dá)和純化75-76
• 4.2.7 chIFITM1-His蛋白與EIF5A1蛋白的相互作用76-77
• 4.2.8 EIF5A1 抑制 NDV 復(fù)制77
• 4.3 討論77-80
• 第五章 全文結(jié)論80-81
• 參考文獻(xiàn)81-91
• 致謝91-92
• 作者簡(jiǎn)歷92

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本文編號(hào)：524561