發(fā)布時間：2017-06-24 03:03

  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄分析煙粉虱應對寄主轉(zhuǎn)換的分子機制及唾液效應因子BtQ56在其中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：煙粉虱Bemisia tabaci是一個物種復合體,至少包含34個外部形態(tài)難以區(qū)分但相互之間存在生殖隔離的隱種。其中,Middle East Asia Minor1(MEAM1)和Mediterranean (MED)煙粉虱是世界范圍的入侵害蟲,己入侵到包括中國在內(nèi)的許多國家和地區(qū)并逐漸取代許多土著煙粉虱,對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大危害。本實驗室之前的研究發(fā)現(xiàn),入侵煙粉虱MEAM1比土著煙粉虱Asia Ⅱ3具有更廣泛的寄主范圍,這可能是其能夠入侵和取代土著煙粉虱的重要原因之一。在自然環(huán)境中,煙粉虱的擴散和繁衍需要應對和利用不同的寄主植物,因此明確不同隱種煙粉虱在寄主適應能力上的差異及寄主適應性的分子機制,對深入了解煙粉虱的入侵機制和煙粉虱-植物互作的復雜關(guān)系有著重要的意義。 本論文首先比較了入侵煙粉虱MEAM1和土著煙粉虱Asia Ⅱ3從其適宜寄主棉花上轉(zhuǎn)移到不適寄主煙草上后死亡率和產(chǎn)卵量的差異。然后通過數(shù)字基因表達譜技術(shù)分析了寄主轉(zhuǎn)換后,兩個隱種煙粉虱在基因轉(zhuǎn)錄水平上的差異。最后結(jié)合煙粉虱唾液腺轉(zhuǎn)錄組,篩選與煙粉虱寄主適應性相關(guān)的唾液效應因子蛋白并研究其功能。研究結(jié)果如下： (1) MEAM1煙粉虱具有更強的適應寄主轉(zhuǎn)換的能力 當MEAM1和Asia Ⅱ3煙粉虱從棉花上轉(zhuǎn)移到煙草上24h后,其死亡率和繁殖力都發(fā)生顯著變化,但MEAM1的死亡率顯著低于AsiaⅡ3煙粉虱,而MEAM1的單頭產(chǎn)卵量則要顯著高于Asia Ⅱ3,這說明與Asia Ⅱ3煙粉虱相比MEAM1煙粉虱具有更強的適應非適宜寄主的能力。 (2)寄主轉(zhuǎn)移后NIE AM1和Asia Ⅱ3煙粉虱的基因轉(zhuǎn)錄差異 通過數(shù)字基因表達譜分析了NIE AMI和Asia Ⅱ3煙粉虱寄主轉(zhuǎn)換前后的基因表達的不同,發(fā)現(xiàn)兩個隱種煙粉虱的基因轉(zhuǎn)錄存在巨大差異,MEAM1煙粉虱的差異表達基因數(shù)量遠小與AsiaⅡ3。AsiaⅡ3煙粉虱的差異表達基因的變化倍數(shù)更大且以下調(diào)為主,而MEAM1的差異表達基因的變化倍數(shù)較小且多為上調(diào)。寄主轉(zhuǎn)換后,Asia Ⅱ3煙粉虱的碳水化合物及能量代謝途徑受到了顯著的抑制,而MEAM1煙粉虱則受影響不大。此外,MEAM1煙粉虱的基因表達和蛋白代謝途徑在寄主轉(zhuǎn)換后被激活。相對于解毒酶基因在MEA M1煙粉虱中的持續(xù)高表達,絕大多數(shù)的解毒酶基因在Asia Ⅱ3中下調(diào)。P450、GST和酯酶的酶活力測定進一步證明了MEAM1煙粉虱的解毒代謝能力比AsiaⅡ3煙粉虱強。 (3)唾液蛋白BtQ56在寄主轉(zhuǎn)換中的作用 結(jié)合表達譜和唾液腺轉(zhuǎn)錄組信息,我們篩選了68個可能與寄主適應性相關(guān)的疑似唾液蛋白基因,通過RNAi和植物瞬時表達等方法發(fā)現(xiàn)一個唾液蛋白BtQ56具有促進煙粉虱存活和產(chǎn)卵的功能。BtQ56基因是一個在煙粉虱唾液腺中特異性高表達的功能未知基因,氨基酸序列含有信號肽且不含跨膜區(qū),具有典型的分泌蛋白結(jié)構(gòu),且未在GeneBank中檢索到任何同源基因或保守的功能結(jié)構(gòu)域。BtQ56基因在入侵煙粉虱MEAM1和MED中的表達量遠遠高于土著Asia Ⅱ3煙粉虱。在寄主轉(zhuǎn)換后BtQ56基因在NE AMI和MED煙粉虱中顯著上調(diào),而Asia Ⅱ3煙粉虱中變化不大,這表明大量的BtQ56可能在寄主轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮著重要作用。通過Western blot的方法,我們在煙粉虱取食過的植物中檢測到了BtQ56蛋白,從而證明BtQ56是一個煙粉虱唾液分泌蛋白。為進一步明確BtQ56是如何增強煙粉虱寄主適應性的,我們分析了BtQ56作用于植物后對植物防御反應相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響,發(fā)現(xiàn)BtQ56可能誘導SA途徑并抑制JA途徑及植物蛋白酶抑制劑基因的轉(zhuǎn)錄,以此達到抑制植物抗性促進煙粉虱存活的目的。 綜上所述,在煙粉虱應對非適宜寄主的過程中,入侵煙粉虱與土著隱種煙粉虱之間在適應能力上存在明顯差異。從棉花轉(zhuǎn)移到煙草后,碳水化合物及能量代謝和解毒代謝在Asia Ⅱ3煙粉虱中受到顯著的抑制,而在MEAM1中變化不大,說明MEAM1在這些方面具有較強的耐受能力�；虮磉_和蛋白代謝途徑在MEAM1煙粉虱中的激活可能是MEAM1具有較強寄主轉(zhuǎn)換適應能力的重要原因。除此之外,唾液效應蛋白BtQ56在煙粉虱應對煙草防御反應的過程中發(fā)揮著重要的作用。
【關(guān)鍵詞】：煙粉虱 寄主轉(zhuǎn)換 表達譜 唾液腺 唾液蛋白 瞬時表達 基因沉默 害蟲誘導的防御反應
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S433
【目錄】：

• 致謝6-8
• 摘要8-10
• Abstract10-15
• 1 文獻綜述及研究目的15-32
• 1.1 煙粉虱概述15-21
• 1.1.1 煙粉虱的生物學特性、分類和種系發(fā)生狀況15-16
• 1.1.2 煙粉虱的經(jīng)濟重要性及危害方式16-18
• 1.1.3 煙粉虱的入侵和競爭取代的機制18-21
• 1.2 煙粉虱適應不同寄主植物的機制21-23
• 1.2.1 取食行為與營養(yǎng)代謝21-22
• 1.2.2 生理機制22-23
• 1.3 唾液在調(diào)控植物與昆蟲互作中的作用23-30
• 1.3.1 煙粉虱的唾液腺(salivary glands)23-24
• 1.3.2 唾液的組成及作用24-28
• 1.3.3 刺吸式昆蟲唾液蛋白的研究方法28-30
• 1.4 本研究目的與主要內(nèi)容30-32
• 1.4.1 研究目的30-31
• 1.4.2 研究內(nèi)容31-32
• 2 基本材料和方法32-41
• 2.1 基本材料32-35
• 2.1.1 供試昆蟲及其實驗種群維持32
• 2.1.2 供試植物32
• 2.1.3 生態(tài)學研究主要儀器和設(shè)備32-34
• 2.1.4 生化及分子生物學研究主要儀器和設(shè)備34
• 2.1.5 主要分子生物學試劑34-35
• 2.2 實驗方法35-40
• 2.2.1 煙粉虱基因組DNA的提取35
• 2.2.2 煙粉虱隱種鑒定35-37
• 2.2.3 Total RNA的提取37-38
• 2.2.4 RNA反轉(zhuǎn)錄合成1鏈cDNA38
• 2.2.5 實時熒光定量PCR(qPCR)38-39
• 2.2.6 SDS-PAGE39
• 2.2.7 蛋白印跡Western blot39-40
• 2.2.8 煙粉虱臨時種群的建立及初羽化雌雄蟲的獲得40
• 2.3 數(shù)據(jù)處理與分析40-41
• 3 不同隱種煙粉虱寄主轉(zhuǎn)換的表達譜分析41-62
• 3.1 材料與方法41-45
• 3.1.1 供試昆蟲與植物41
• 3.1.2 寄主轉(zhuǎn)換實驗41
• 3.1.3 RNA提取,DGE文庫構(gòu)建和Illumina測序41-42
• 3.1.4 標簽注釋及基因表達水平的標準化42
• 3.1.5 差異基因表達分析42-43
• 3.1.6 GO及KEGG pathway富集分析43
• 3.1.7 實時熒光定量PCR(qPCR)分析驗證表達譜數(shù)據(jù)43
• 3.1.8 解毒酶活性測定43-45
• 3.2 實驗結(jié)果與分析45-59
• 3.2.1 寄主轉(zhuǎn)移后煙粉虱的死亡率和產(chǎn)卵量45-46
• 3.2.2 寄主轉(zhuǎn)移后MEAM1和AsiaⅡ3煙粉虱的基因表達差異46-48
• 3.2.3 GO及KEGG pathway分析48-52
• 3.2.4 寄主轉(zhuǎn)換抑制AsiaⅡ3煙粉虱的碳水化合物及能量代謝52-54
• 3.2.5 寄主轉(zhuǎn)換后MEAM1煙粉虱的基因表達和蛋白質(zhì)代謝變化54-55
• 3.2.6 MEAM1和AsiaⅡ3煙粉虱在解毒酶基因表達調(diào)控方面的差異55-57
• 3.2.7 MEAM1和AsiaⅡ3煙粉虱寄主轉(zhuǎn)換后解毒酶活性的變化57-59
• 3.3 小結(jié)與討論59-62
• 4 煙粉虱唾液效應因子BTQ56在寄主轉(zhuǎn)換中的作用62-89
• 4.1 材料與方法62-71
• 4.1.1 供試昆蟲與植物62-63
• 4.1.2 煙粉虱疑似唾液效應因子BtQ56基因的克隆和與序列分析63-64
• 4.1.3 熒光定量PCR檢測BtQ56基因在各組織和發(fā)育階段的表達64
• 4.1.4 熒光定量PCR檢測BtQ56基因在寄主轉(zhuǎn)換后的差異表達64
• 4.1.5 原核表達及多抗制備64-65
• 4.1.6 免疫熒光檢測BtQ56在煙粉虱各組織的表達65-66
• 4.1.7 唾液分泌蛋白驗證實驗66
• 4.1.8 雙鏈RNA(dsRNA)的合成66
• 4.1.9 飼喂法沉默BtQ56基因及沉默效果驗證66-67
• 4.1.10 RANi后煙粉虱生物測定67
• 4.1.11 瞬時表達載體的構(gòu)建及表達驗證67-70
• 4.1.12 煙粉虱在瞬時表達BtQ56基因煙草上的存活率和單雌產(chǎn)卵量70
• 4.1.13 BtQ56基因?qū)煵莘烙虻恼{(diào)控70-71
• 4.1.14 數(shù)據(jù)分析71
• 4.2 結(jié)果與分析71-85
• 4.2.1 BtQ56基因的克隆與序列分析71-74
• 4.2.2 BtQ56基因在煙粉虱在發(fā)育階段的表達模式74-75
• 4.2.3 BtQ56基因在煙粉虱不同隱種和寄主轉(zhuǎn)換后的表達差異75-76
• 4.2.4 BtQ56的原核表達和多克隆抗體制備76-77
• 4.2.5 BtQ56在煙粉虱組織中的分布77-78
• 4.2.6 Western blot驗證BtQ56為煙粉虱唾液分泌蛋白78-79
• 4.2.7 飼喂dsRNA對煙粉虱BtQ56基因表達水平的影響79-80
• 4.2.8 RNAi干擾BtQ56基因?qū)煼凼婊盥实挠绊?/span>80-81
• 4.2.9 EGFP基因在煙草和棉花中的瞬時表達驗證81-82
• 4.2.10 BtQ56基因在植物中瞬時表達促進煙粉虱的存活和產(chǎn)卵82
• 4.2.11 瞬時表達BtQ56基因?qū)煵莘烙嚓P(guān)基因的影響82-85
• 4.3 小結(jié)與討論85-89
• 5 全文總結(jié)89-91
• 5.1 全文小結(jié)89-90
• 5.2 創(chuàng)新之處90
• 5.3 值得繼續(xù)研究的問題90-91
• 參考文獻91-102
• 附錄102-109

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄分析煙粉虱應對寄主轉(zhuǎn)換的分子機制及唾液效應因子BtQ56在其中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：476918