本文關(guān)鍵詞：柔嫩艾美耳球蟲端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶互作蛋白的篩選及功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：艾美耳球蟲作為細胞內(nèi)寄生蟲，寄生于雞腸道內(nèi)引起是由以腸道病變?yōu)橹饕卣鞯碾u球蟲病并嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。目前控制球蟲病還是主要依賴抗球蟲藥和疫苗的使用，但由于對球蟲的細胞和分子生物學(xué)等缺乏詳盡的了解，迄今尚無理想的控制雞球蟲病的藥物和疫苗。端粒酶及相關(guān)蛋白的發(fā)現(xiàn)為深入研究球蟲的細胞和分子生物學(xué)特性以及尋找新的防治雞球蟲的藥物和疫苗作用靶位等開辟了新的研究領(lǐng)域。 端粒酶作為一種核糖核蛋白，由端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)、端粒酶RNA和端粒酶相關(guān)蛋白三個亞單位組成，其以自身攜帶的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成新的端粒DNA重復(fù)序列以維持染色體端粒的穩(wěn)定性。而TERT是具有催化活性的亞單位。隨著對端粒酶研究的深入，先后報道了多種端粒酶相關(guān)蛋白，并發(fā)現(xiàn)這些蛋白在端粒酶活性調(diào)節(jié)過程中起重要作用。應(yīng)用酵母雙雜交篩選到的hTERT互作蛋白p23，與Hsp90共同在端粒酶的高效組裝和活化中發(fā)揮作用。PinX能與hTERT的RNA結(jié)合域（326~620aa）結(jié)合，并也能結(jié)合端粒酶RNA，在酵母中hPinX同源物是一個酵母端粒酶功能負向調(diào)節(jié)因子。四膜蟲p65和p45作為端粒酶的一部分在端粒維持方面發(fā)揮必要的作用。目前，柔嫩艾美耳球蟲（E. tenella）的TERT序列已經(jīng)成功克隆出來，而端粒-like序列已被預(yù)測出來。這些表明E. tenella利用傳統(tǒng)的端粒酶機制合成其端粒DNA維持染色體末端的穩(wěn)定。但尚無TERT相關(guān)蛋白的報道。故本研究通過酵母雙雜交篩選、pull-down以及免疫共沉淀技術(shù)鑒定TERT互作蛋白14-3-3，進而利用病毒載體介導(dǎo)的錘頭狀核酶探討14-3-3在端粒酶調(diào)節(jié)中的功能。 E. tenella酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建：收集純化E. tenella孢子化卵囊，Trizol提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SMART技術(shù)建立E. tenella酵母雙雜交cDNA文庫。文庫滴度為5×107cfu/mL，容量為2×1010cfu。隨機挑選的48個克隆菌插入片段平均大小0.8~2kb，文庫重組率高。 E.tenella誘餌表達質(zhì)粒pGBKT7-TRBD的構(gòu)建及其互作蛋白的篩選：將PCR獲得的E. tenella TERT RNA結(jié)合域（TRBD）片段與誘餌載體pGBKT7連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pGBKT7-TRBD，并轉(zhuǎn)化入酵母感受態(tài)細胞中。結(jié)果表明，誘餌蛋白能在酵母菌中表達且對宿主菌無毒性作用。-半乳糖苷酶試驗表明誘餌蛋白無自激活作用。將pGBKT7-TRBD/Y187與酵母雙雜交cDNA文庫共培養(yǎng)篩選互作蛋白，初步篩選到了TRBD互作蛋白核仁素、14-3-3和尿苷磷酸化酶。-半乳糖苷酶試驗表明14-3-3與TRBD間存在相互作用。 TRBD與14-3-3蛋白相互作用的鑒定：將TRBD和14-3-3基因分別克隆至原核表達載體pET-32a和pGEX-4T-1，并在大腸桿菌中進行原核表達和純化。SDS-PAGE顯示二者均能以可溶性蛋白的形式表達。將純化的His-TRBD/GST-14-3-3共孵育，通過pull-down試驗驗證兩種蛋白的相互作用。結(jié)果表明，E. tenella TRBD蛋白與14-3-3蛋白在體外具有相互作用。 構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA-3.1-Myc-TRBD和pcDNA-3.1-HA-14-3-3，共轉(zhuǎn)染293T細胞，Western blot顯示Myc-TRBD和HA-14-3-3均能在293T細胞中表達。免疫共沉淀結(jié)果表明Myc-TRBD蛋白與HA-14-3-3蛋白在真核細胞內(nèi)具有相互作用。 14-3-3蛋白的功能研究：設(shè)計合成針對14-3-3基因的的錘頭狀核酶并連接到E. tenella病毒載體上獲得pEtV-RFP-Ham-14-3-3，進行體內(nèi)和體外對14-3-3基因切割研究。體外試驗表明pEtV-RFP-Ham-14-3-3體外轉(zhuǎn)錄體對14-3-3體外轉(zhuǎn)錄體切割效率達到85.24%。通過電轉(zhuǎn)染方法，將pEtV-RFP-Ham-14-3-3體外轉(zhuǎn)錄體導(dǎo)入E. tenella體內(nèi)，Western blot檢測顯示在球蟲體內(nèi)核酶對14-3-3基因具有一定的切割效率，14-3-3表達水平相對于RFP-GFP株下調(diào)11.24%。當(dāng)14-3-3基因表達被抑制后，E. tenella端粒酶活性升高，初步表明14-3-3可能對于端粒酶活性具有負向調(diào)節(jié)的作用。 綜上所述，本研究完成了E. tenella酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建并篩選到了TERT相互作用蛋白14-3-3，pull-down和免疫共沉淀結(jié)果進一步證明了兩種蛋白的相互作用。利用E. tenella病毒載體介導(dǎo)的核酶干擾了14-3-3在球蟲體內(nèi)的表達，從而初步表明14-3-3可能對于端粒酶活性具有負向調(diào)節(jié)的作用。本研究為深入探討14-3-3調(diào)節(jié)端粒酶活性的機制以及尋找新的防治球蟲病的藥物和疫苗分子靶位奠定了重要基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：柔嫩艾美耳球蟲 酵母雙雜交 TRBD 14-3-3 蛋白相互作用 核酶 端粒酶活性
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.31
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 英文縮寫詞表10-14
• 引言14-16
• 第一篇 文獻綜述16-38
• 第1章 雞球蟲分子生物學(xué)研究進展16-26
• 1 基因組學(xué)16-17
• 2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)17-18
• 3 蛋白組學(xué)18-19
• 4 宿主細胞入侵19-21
• 5 雞球蟲分子生物學(xué)診斷方法21-24
• 6 球蟲防控新方法24-26
• 第2章 端粒酶及相關(guān)蛋白研究進展26-32
• 1 端粒酶26-29
• 2 端粒酶相關(guān)蛋白29-32
• 第3章 原蟲基因功能研究方法32-38
• 1 轉(zhuǎn)染32-33
• 2 RNAi33-35
• 3 基因敲除35-36
• 4 核酶36-38
• 第二篇 研究內(nèi)容38-94
• 第1章 E. tenella 酵母雙雜交 cDNA 文庫的構(gòu)建38-49
• 1 材料與方法38-44
• 2 結(jié)果44-47
• 3 討論47-48
• 4 小結(jié)48-49
• 第2章 E.tenella TERT 誘餌表達質(zhì)粒的構(gòu)建及其互作蛋白的篩選49-63
• 1 材料與方法49-56
• 2 結(jié)果56-61
• 3 討論61-62
• 4 小結(jié)62-63
• 第3章 TERT 與 14-3-3 蛋白相互作用的鑒定63-77
• 1 材料與方法63-69
• 2 結(jié)果69-75
• 3 討論75-76
• 4 小結(jié)76-77
• 第4章 14-3-3 蛋白的功能研究77-94
• 1 材料與方法77-85
• 2 結(jié)果85-91
• 3 討論91-93
• 4 小結(jié)93-94
• 結(jié)論94-96
• 參考文獻96-112
• 學(xué)術(shù)論文及發(fā)表情況112-114
• 導(dǎo)師簡介114-116
• 作者簡介116-118
• 致謝118

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李先昆;聶智毅;曾日中;;酵母雙雜交技術(shù)研究與應(yīng)用進展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年07期

2 朱利軍;長孫東亭;羅素蘭;;全長cDNA文庫構(gòu)建方法及應(yīng)用研究[J];海南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2009年02期

3 朱雅新,麻浩;端粒和端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能及其應(yīng)用[J];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2005年01期

4 解庭波;;大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究進展[J];長江大學(xué)學(xué)報(自科版)醫(yī)學(xué)卷;2008年03期

5 ;《RNA實驗技術(shù)手冊》(分子克隆實驗指南系列)[J];科學(xué)通報;2004年17期

6 杜貽鵬;周俊宜;;人類端粒酶RNA組分的研究進展[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2006年01期

7 屈藝,劉菽秋,彭文珍,劉柏林;人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核酶抑制端粒酶活性的實驗研究[J];四川大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2002年S1期

8 石健林,章為,周雪;核酶技術(shù)簡介[J];四川解剖學(xué)雜志;2002年01期

9 童夏靜;周金秋;;端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)及其生物學(xué)意義[J];生命科學(xué);2009年06期

10 劉衛(wèi)輝;竇科峰;;SMART技術(shù)及其應(yīng)用進展[J];中國生物工程雜志;2008年06期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 李凌丹;犬賈第蟲不同蟲株及發(fā)育階段的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];吉林大學(xué);2012年

2 周麗娜;一種新的hTERT相互作用蛋白的篩選及鑒定[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：柔嫩艾美耳球蟲端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶互作蛋白的篩選及功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：407176