本文關(guān)鍵詞：家蠶后部絲腺基因表達(dá)差異的分析與蠶絲性能改良的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：家蠶是鱗翅目泌絲型經(jīng)濟(jì)昆蟲,絲腺是合成分泌絲蛋白、決定蠶絲產(chǎn)量和質(zhì)量的重要組織器官。絲腺具有高效合成絲蛋白的能力,但采用家蠶絲腺生物反應(yīng)器表達(dá)外源蛋白時(shí),至今為止的所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都證明外源蛋白的表達(dá)量很低,極大多數(shù)僅占繭絲蛋白含量的百分之幾。為了利用具有極強(qiáng)機(jī)械性能的黑寡婦蜘蛛牽引絲改良家蠶絲纖維的機(jī)械性能,本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究了家蠶后部絲腺基因表達(dá)調(diào)控的特征,初步揭示了絲腺高效合成絲蛋白的分子機(jī)制,提供了利用絲腺高效表達(dá)蜘蛛絲蛋白的方法和策略；本研究采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)建了含有蜘蛛絲蛋白的家蠶品種,極大地改良了蠶絲的機(jī)械性能。具體取得的研究結(jié)果如下：1.轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示了影響蠶絲蛋白合成的代謝通路以秋豐、裸蛹(Nd)和絲膠繭(Nd-s)3個(gè)家蠶品種5齡第3天后部絲腺為材料,采用RNA-seq高通量測序的轉(zhuǎn)錄組研究方法,結(jié)果表明Nd和Nd-s這2個(gè)低絲量的突變品種中,組成繭絲蛋白基因的表達(dá)水平下降,導(dǎo)致絲產(chǎn)量降低；與絲腺生長發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào),阻礙了絲腺的發(fā)育,影響了絲蛋白的正常合成；絲腺組織中合成了大量不成熟的、錯(cuò)誤折疊的蛋白,造成蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)和抗氧化代謝等一系列耗能的代謝增加,大量的能量被空耗在用來維持細(xì)胞自身的穩(wěn)態(tài)上面,最終影響了絲蛋白的合成代謝。2.蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了影響蠶絲蛋白合成的代謝通路采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析相同的實(shí)驗(yàn)材料,用同位素標(biāo)記定量法(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析得知,Nd和Nd-s這2個(gè)低絲量的突變品種的繭絲關(guān)鍵蛋白表達(dá)量下降,絲腺發(fā)育相關(guān)的蛋白表達(dá)下調(diào),絲蛋白合成及信號通路相關(guān)的蛋白表達(dá)下調(diào),絲蛋白的分泌及運(yùn)輸途徑相關(guān)的蛋白也受到影響,大量的能量被空耗到無效的代謝途徑上,最終影響了絲蛋白的高效合成。3.采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良了家蠶繭絲的機(jī)械性能以piggyBac載體為基礎(chǔ),根據(jù)黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白設(shè)計(jì)并成功構(gòu)建了包含不同重復(fù)單元的類MaSp1和MaSp2的系列載體,利用顯微注射的方法,將其整合到家蠶的基因組內(nèi),經(jīng)Inverse-PCR、Q-PCR、Western blotting等方法的檢測,證明已成功獲得了16個(gè)轉(zhuǎn)蜘蛛絲基因家蠶品系。這些品系的繭絲的機(jī)械性能顯著提高,與野生型對照品種相比,最大應(yīng)力最高提高71.92%,最大應(yīng)變提高34.508%,楊氏模量提高57.819%,韌性最高提高131.673%。4.證明了黑寡婦蜘蛛牽引絲的機(jī)械性能與其蛋白分子量大小成極顯著的線性關(guān)系采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了類黑寡婦蜘蛛Black Widow Spider, Latrodectus hesperus牽引絲MaSpl基因不同長度的分子的轉(zhuǎn)基因蜘蛛絲家蠶,根據(jù)多個(gè)轉(zhuǎn)基因家系以及雜合型和純化型2種基因型對比研究結(jié)果,都證明了分子越長絲的機(jī)械性能越好,說明黑寡婦蜘蛛牽引絲的超級性能來源于她的分子長度,暗示了自然界機(jī)械性能優(yōu)良的蛋白性絲纖維都采用高度重復(fù)的大分子蛋白的策略是生物進(jìn)化的一種必然結(jié)果。綜上所述,本研究通過對秋豐、裸蛹(Nd)和絲膠繭(Nd-s)3個(gè)家蠶品種的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組差異表達(dá)譜分析,揭示了絲蛋白高效合成的機(jī)制,為改良家蠶絲腺特性,作為生物反應(yīng)器高效地合成外源蛋白奠定了分子基礎(chǔ)。本研究采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建了轉(zhuǎn)蜘蛛絲基因家蠶品種,顯著提高了家蠶繭絲的機(jī)械性能,并證明了絲纖維的機(jī)械性能與組成其蛋白分子量之間呈極顯著的線性關(guān)系,為進(jìn)一步改良蠶絲質(zhì)量奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果揭示了如果能夠?qū)倚Q絲腺細(xì)胞基因表達(dá)特征進(jìn)行改良,能夠提高外源蛋白蜘蛛絲的表達(dá)量,同時(shí)導(dǎo)入分子量更大的蜘蛛絲基因,就能夠進(jìn)一步提高蠶絲的機(jī)械性能。
【關(guān)鍵詞】：家蠶 后部絲腺 轉(zhuǎn)錄組 蛋白質(zhì)組 piggyBac 轉(zhuǎn)基因 黑寡婦蜘蛛牽引絲 纖維機(jī)械性能
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;S881.2
【目錄】：

• 致謝(Acknowledgements)6-10
• 摘要10-12
• Abstract12-15
• 第1章 文獻(xiàn)綜述15-36
• 1.1 家蠶絲腺與絲的研究背景15-23
• 1.1.1 絲腺的研究進(jìn)展15-18
• 1.1.2 家蠶繭絲及其突變品種的研究18-21
• 1.1.3 絲腺的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究21-22
• 1.1.4 蠶絲的應(yīng)用22-23
• 1.2 家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展23-26
• 1.3 蜘蛛絲研究進(jìn)展26-32
• 1.3.1 蜘蛛絲種類、結(jié)構(gòu)及性能研究26-31
• 1.3.2 蜘蛛絲蛋白的表達(dá)研究31-32
• 1.3.3 蜘蛛絲的應(yīng)用前景32
• 1.4 采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造蠶絲強(qiáng)度的研究進(jìn)展32-33
• 1.5 研究的目的意義、內(nèi)容及技術(shù)路線33-36
• 1.5.1 研究目的及意義33-34
• 1.5.2 研究內(nèi)容34-35
• 1.5.3 技術(shù)路線35-36
• 第2章 家蠶不同突變品種后部絲腺轉(zhuǎn)錄組的分析36-62
• 2.1 引言36-37
• 2.2 試驗(yàn)材料37
• 2.3 試驗(yàn)方法37-43
• 2.3.1 家蠶后部絲腺的解剖37
• 2.3.2 總RNA的提取37-38
• 2.3.3 轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)38-40
• 2.3.4 生物信息學(xué)的分析40-42
• 2.3.5 熒光定量PCR42-43
• 2.4 結(jié)果43-58
• 2.4.1 總RNA的提取43-44
• 2.4.2 數(shù)據(jù)的基本分析44-46
• 2.4.3 差異基因的分析46-53
• 2.4.4 差異基因GO(Gene Ontology)的分析53-56
• 2.4.5 差異基因KEGG的分析56-57
• 2.4.6 熒光定量PCR(Q-PCR)分析家蠶后部絲腺主要基因的表達(dá)57-58
• 2.5 討論58-62
• 第3章 家蠶不同突變品種后部絲腺蛋白質(zhì)譜的分析62-89
• 3.1 引言62
• 3.2 試驗(yàn)材料62
• 3.3 試驗(yàn)方法62-68
• 3.3.1 家蠶后部絲腺的解剖62
• 3.3.2 蛋白質(zhì)組的表達(dá)譜(iTRAQ)62-66
• 3.3.3 生物信息學(xué)分析66-68
• 3.4 結(jié)果68-83
• 3.4.1 鑒定質(zhì)量的評估及蛋白質(zhì)鑒定68-71
• 3.4.2 差異蛋白質(zhì)的鑒定71-79
• 3.4.3 差異蛋白功能Gene Ontology(GO)分類的分析79-81
• 3.4.4 差異蛋白KEGG分析81-83
• 3.5 轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組之間的比較分析83-84
• 3.6 討論84-89
• 第4章 轉(zhuǎn)蜘蛛絲蛋白改良家蠶繭絲機(jī)械性能的研究89-146
• 4.1 引言89-90
• 4.2 材料和方法90-110
• 4.2.1 試驗(yàn)材料90
• 4.2.2 質(zhì)粒、菌種及主要試劑90-91
• 4.2.3 主要溶液及其配制91-95
• 4.2.4 試驗(yàn)方法95-110
• 4.3 結(jié)果與分析110-144
• 4.3.1 轉(zhuǎn)基因家蠶類蜘蛛絲載體的設(shè)計(jì)及組裝110-117
• 4.3.2 陽性轉(zhuǎn)基因家蠶的篩選與轉(zhuǎn)基因陽性率統(tǒng)計(jì)117-121
• 4.3.3 不同轉(zhuǎn)基因系家蠶插入位點(diǎn)的分析121-129
• 4.3.4 外源蜘蛛絲蛋白表達(dá)鑒定129-132
• 4.3.5 繭絲機(jī)械性能的分析132-138
• 4.3.6 重組蜘蛛絲蛋白的大小與機(jī)械性能之間的關(guān)系138-142
• 4.3.7 共表達(dá)重組MaSp1和MaSp2蛋白機(jī)械性能分析142-144
• 4.4 討論144-146
• 第5章 全文總結(jié)、創(chuàng)新點(diǎn)和研究展望146-149
• 5.1 全文總結(jié)146-148
• 5.2 創(chuàng)新點(diǎn)148
• 5.3 研究展望148-149
• 附件149-164
• 參考文獻(xiàn)164-171
• 攻讀博士期間的研究成果171-173
• 博士期間參加的學(xué)術(shù)會議173

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張陽;趙愛春;陳雪嬌;魯成;向仲懷;;一種新的單根繭絲纖維橫截面積測量方法[J];蠶業(yè)科學(xué);2011年05期

  本文關(guān)鍵詞：家蠶后部絲腺基因表達(dá)差異的分析與蠶絲性能改良的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：392959