哺乳動物超過99%的卵子在發(fā)育過程中都會經(jīng)歷閉鎖性退化而不排卵,在促性腺激素的作用下,其中一些可以達(dá)到排卵前階段,為了促進(jìn)瀕危物種以及基因優(yōu)良畜禽體外培養(yǎng)卵子更好的應(yīng)用,卵子發(fā)生和卵泡發(fā)育的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。顆粒細(xì)胞分泌的激素和生長因子對卵泡發(fā)育起重要作用,同時卵母細(xì)胞分泌各種生長因子也可以調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖和分化。在卵泡液中含有多種不同水平的類固醇激素,比如雌激素、孕酮和雄激素,可以通過作用于顆粒細(xì)胞生長以及卵泡液的形成來影響卵巢的卵泡發(fā)育。近年來很多的研究表明,Wnt信號可以調(diào)節(jié)小鼠和人類的性腺發(fā)育和性別分化,并且可以調(diào)節(jié)激素的合成和分泌,對哺乳動物卵泡形成和發(fā)育以及卵巢功能的維持具有重要作用,可以參與調(diào)控卵泡閉鎖等生理過程。Wnt5a和Wnt11屬于非經(jīng)典Wnt蛋白,它們在顆粒細(xì)胞中表達(dá)并且在整個卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮特異的調(diào)控作用。當(dāng)顆粒細(xì)胞Wnt5a失去活性的時候可以導(dǎo)致小鼠卵泡閉鎖增加和排卵率降低。然而Wnt非典型通路對豬卵泡發(fā)育的作用尚未見系統(tǒng)報道,本文探究Wnt/PLC/Ca²⁺通路對豬卵泡發(fā)育過程中凋亡和激素分泌的影響。本試驗通過抽吸法取得直徑為2...

【文章頁數(shù)】：143 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號對照表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞在哺乳動物卵泡閉鎖和激素分泌中的作用
        1.1.1 哺乳動物卵巢的基本結(jié)構(gòu)和功能
        1.1.2 卵泡發(fā)育的基本過程
        1.1.3 卵泡發(fā)育的調(diào)控途徑
        1.1.4 顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育中的作用
        1.1.5 卵母細(xì)胞的發(fā)育以及在卵泡發(fā)育中的作用
        1.1.6 顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞的互作
    1.2 Wnt-Ca²⁺信號通路對卵泡發(fā)育的影響
        1.2.1 Wnt通路概述以及Wnt-Ca²⁺通路的組成
        1.2.2 Wnt-Ca²⁺通路在哺乳動物生理病理活動中的調(diào)節(jié)作用
        1.2.3 Wnt-Ca²⁺與Wnt典型通路的互作
        1.2.4 Wnt-Ca²⁺與其它信號通路的關(guān)系
    1.3 研究目的和意義
第二章 Wnt/PLC/Ca²⁺信號變化對豬顆粒細(xì)胞活力和卵母細(xì)胞成熟的調(diào)控
    2.1 前言
    2.2 試驗材料
        2.2.1 主要試劑
        2.2.2 主要試驗儀器
        2.2.3 試驗動物來源
    2.3 試驗方法
        2.3.1 豬卵巢的采集
        2.3.2 豬顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.3.3 豬顆粒細(xì)胞的鑒定
        2.3.4 CCK8法測定顆粒細(xì)胞活力
        2.3.5 卵母細(xì)胞成熟的判定
        2.3.6 孤雌激活和早期胚胎培養(yǎng)
        2.3.7 早期胚胎發(fā)育的評定
        2.3.8 統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 豬顆粒細(xì)胞的鑒定
        2.4.2 不同濃度IWP-2對豬顆粒細(xì)胞活力的影響
        2.4.3 不同濃度抑制劑U73122對顆粒細(xì)胞活力的影響
        2.4.4 不同濃度激活劑m-3M3FBS對顆粒細(xì)胞活力的影響
        2.4.5 不同濃度IWP-2對豬卵母細(xì)胞第一極體排出率的影響
        2.4.6 不同濃度抑制劑U73122 或激活劑m-3M3FBS對卵母細(xì)胞成熟的影響.
    2.5 討論
    2.6 小結(jié)
第三章 IWP-2對Wnt/PLC/Ca²⁺通路的抑制、對凋亡的促進(jìn)及其對顆粒細(xì)胞激素的調(diào)控
    3.1 前言
    3.2 試驗材料
        3.2.1 主要試劑
        3.2.2 主要試驗儀器
    3.3 試驗方法
        3.3.1 豬卵巢的采集以及豬顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.3.2 豬顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞鈣離子濃度的測定
        3.3.3 豬顆粒細(xì)胞RNA提取和反轉(zhuǎn)錄
        3.3.4 實時熒光定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因和激素調(diào)控基因的表達(dá)水平
        3.3.5 Western Blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白和PLC四種亞基蛋白表達(dá)水平
        3.3.6 統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 IWP-2對豬顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中Ca²⁺濃度的影響
        3.4.2 IWP-2對豬顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞凋亡的影響
        3.4.3 IWP-2對顆粒細(xì)胞雌二醇和孕酮調(diào)控基因的影響
        3.4.4 IWP-2 對豬顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞PLC四種亞基基因和蛋白表達(dá)的影響.
    3.5 討論
    3.6 小結(jié)
第四章 PLC蛋白對豬卵泡發(fā)育過程中細(xì)胞凋亡、激素分泌和Wnt/Ca²⁺信號通路的影響
    4.1 前言
    4.2 試驗材料
        4.2.1 主要試劑
        4.2.2 主要試驗儀器
    4.3 試驗方法
        4.3.1 豬卵巢的采集以及顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的培養(yǎng)
        4.3.2 顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄
        4.3.3 實時熒光定量PCR檢測凋亡、激素和Wnt/Ca²⁺通路若干基因的表達(dá)
        4.3.4 Western Blot法檢測凋亡和Wnt/Ca²⁺通路相關(guān)蛋白的表達(dá)
        4.3.5 Annexin V-FITC法檢測豬顆粒細(xì)胞凋亡
        4.3.6 酶聯(lián)免疫法(ELISA法)測定豬雌二醇和孕酮的含量
        4.3.7 豬顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞鈣離子濃度測定
        4.3.8 統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析
    4.4 結(jié)果與分析
        4.4.1 PLC蛋白對豬顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞凋亡的調(diào)控
        4.4.2 PLC蛋白對豬顆粒細(xì)胞雌二醇和孕酮分泌的調(diào)控
        4.4.3 PLC蛋白對豬顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞Wnt/Ca²⁺信號中PLC四個亞基、Ca²⁺濃度、三個鈣離子敏感蛋白和若干下游基因的調(diào)控
    4.5 討論
    4.6 小結(jié)
第五章 IWP-2與U73122或m-3M3FBS互作對豬卵泡Ca²⁺的調(diào)節(jié)以及對顆粒細(xì)胞凋亡和激素的調(diào)節(jié)作用
    5.1 前言
    5.2 試驗材料
        5.2.1 主要試劑
        5.2.2 主要試驗儀器
    5.3 試驗方法
        5.3.1 豬卵巢的采集以及顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的培養(yǎng)
        5.3.2 豬顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞鈣離子濃度檢測
        5.3.3 顆粒細(xì)胞總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄
        5.3.4 實時熒光定量PCR檢測顆粒細(xì)胞凋亡和激素調(diào)控基因相對表達(dá)
        5.3.5 統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析
    5.4 結(jié)果與分析
        5.4.1 IWP-2與U73122或m-3M3FBS相互作用對豬顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞Ca²⁺濃度的影響
        5.4.2 IWP-2與U73122或m-3M3FBS相互作用對顆粒細(xì)胞凋亡調(diào)控基因的影響
        5.4.3 IWP-2與U73122或m-3M3FBS相互作用對顆粒細(xì)胞激素調(diào)控基因的影響
    5.5 討論
    5.6 小結(jié)
第六章 Enzastaurin或 Enzastaurin與 U73122 互作對豬顆粒細(xì)胞激素和凋亡的調(diào)節(jié)作用
    6.1 前言
    6.2 試驗材料
        6.2.1 主要試劑
        6.2.2 主要試驗儀器
    6.3 試驗方法
        6.3.1 豬卵巢的采集以及顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)
        6.3.2 豬顆粒細(xì)胞總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄
        6.3.3 實時熒光定量PCR檢測豬顆粒細(xì)胞凋亡和激素調(diào)控基因相對表達(dá)
        6.3.4 Western Blot法檢測豬顆粒細(xì)胞PKC蛋白表達(dá)的影響
    6.4 結(jié)果與分析
        6.4.1 Enzastaurin對豬顆粒細(xì)胞活力的影響
        6.4.2 Enzastaurin以及Enzastaurin與 U73122 互作對豬顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響
        6.4.3 Enzastaurin以及Enzastaurin與 U73122 互作對豬顆粒細(xì)胞雌二醇和孕酮激素相關(guān)基因表達(dá)的影響
        6.4.4 Enzastaurin以及Enzastaurin與 U73122 互作對PKCβ蛋白表達(dá)的影響
    6.5 討論
    6.6 小結(jié)
第七章 結(jié)論與創(chuàng)新點
    7.1 結(jié)論
    7.2 創(chuàng)新點
下一步研究工作
附錄
參考文獻(xiàn)
致謝
個人簡歷



本文編號：3868247