本文關(guān)鍵詞：二氫沉香呋喃多元酯類殺蟲活性化合物作用靶標(biāo)的鑒定和驗(yàn)證，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：新農(nóng)藥創(chuàng)制的基礎(chǔ)是靶標(biāo)的創(chuàng)新,研究藥物作用靶標(biāo)可以為新農(nóng)藥的創(chuàng)制提供思路,而以天然產(chǎn)物為探針是發(fā)現(xiàn)新靶標(biāo)的主要途徑。從植物苦皮藤根皮部分離鑒定出的一系列二氫沉香呋喃多元酯類化合物具有殺蟲活性,但其作用機(jī)理尚不明確。本文以東方粘蟲幼蟲(Mythimna separata Walker)為供試?yán)ハx,對(duì)二氫沉香呋喃多元酯類殺蟲活性化合物的作用靶標(biāo)進(jìn)行了鑒定和驗(yàn)證,為創(chuàng)制一類作用于昆蟲消化系統(tǒng)的新型殺蟲劑提供新的思路。主要研究方法與結(jié)果如下:1.采用靶標(biāo)鑒定的親和層析方法,以苦皮藤素V為二氫沉香呋喃多元酯類殺蟲活性化合物的代表,在其C-6位衍生合成氨基乙酸酯,通過(guò)自發(fā)偶聯(lián)與CNBr活化的Sepharose 4B反應(yīng)生成親和基質(zhì),從粘蟲幼蟲中腸BBMV提取物中分離結(jié)合蛋白。經(jīng)質(zhì)譜鑒定,獲得11個(gè)如下結(jié)合蛋白:鋅指蛋白(Zinc finger protein)、跨膜蛋白1(Transmembrane protein 1)、硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶(Thioredoxin peroxidase(TPx))、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)、E3 SUMO-蛋白連接酶RanBP2(SUMO E3 ligase RanBP2)、肌動(dòng)蛋白(actin)、氨肽酶N3(APN3)、V-ATPase a亞基、B亞基和H亞基。結(jié)合文獻(xiàn)已報(bào)道的前期癥狀學(xué)觀察結(jié)果及這些蛋白的功能推測(cè)可知,APN和V-ATPase為疑似靶酶。2.采用口腔直接飼喂法測(cè)定了12個(gè)供試二氫沉香呋喃多元酯類化合物對(duì)5齡粘蟲的毒力,供試化合物KV-6-N-甲基靛紅酸酯(KV-6-MIA)、KV-6-異丁酸酯、KV-6-酮、NW57、NW62在供試濃度668.45μg/g劑量下對(duì)供試5齡粘蟲不表現(xiàn)出胃毒活性;雷公藤次堿(WR)、苦皮藤素V(KV)、KV-6-α-氨基丙酸酯、KV-6-氨基乙酸酯、NW69、NW03、NW70對(duì)供試5齡粘蟲有胃毒活性,LD50分別為:0.597、679.479、33.605、767.811、309.559、379.286、86.271μg/g。測(cè)定了12個(gè)供試二氫沉香呋喃多元酯類化合物對(duì)粘蟲幼蟲中腸APN和V-ATPase活性的影響,結(jié)果表明,該類化合物對(duì)APN活性沒(méi)有影響,但是大多數(shù)該類化合物對(duì)V-ATPase活性有抑制作用。供試化合物苦皮藤素V(KV)、KV-6-α-氨基丙酸酯、KV-6-氨基乙酸酯、KV-6-異丁酸酯、KV-6-酮、KV-6-N-甲基靛紅酸酯(KV-6-MIA)、NW69、NW70、NW03、NW57、NW62、雷公藤次堿(WR)對(duì)V-ATPase活性的抑制率分別為:14.19%、19.83%、12.72%、12.30%、6.72%、24.04%、12.63%、29.64%、33.98%、1.9%、6.90%、54.78%。供試化合物的殺蟲活性與對(duì)試蟲中腸V-ATPase的抑制活性呈正相關(guān)性,說(shuō)明二氫沉香呋喃多元酯類殺蟲活性化合物的作用靶酶為V-ATPase。3.基于V-ATPase H亞基功能的重要性,采用RACE技術(shù)對(duì)粘蟲幼蟲中腸V-ATPase H亞基進(jìn)行克隆。獲得了粘蟲幼蟲中腸H亞基基因1807 bp,其中CDS區(qū)基因的全長(zhǎng)共1425 bp,5'-UTR為136 bp,3'-UTR為246 bp。CDS區(qū)編碼474個(gè)氨基酸,經(jīng)預(yù)測(cè)編碼氨基酸的分子量為54.8 KDa,等電點(diǎn)(pI)為6.26。4.采用微量熱泳動(dòng)(MST)技術(shù),測(cè)定供試12個(gè)二氫沉香呋喃多元酯類化合物與H亞基的相互作用,結(jié)果表明KV-6-酮、KV-6-N-甲基靛紅酸酯(KV-6-MIA)、KV-6-異丁酸酯、NW57、NW62不與H亞基結(jié)合,苦皮藤素V(KV)、KV-6-α-氨基丙酸酯、KV-6-氨基乙酸酯、NW70、NW69、NW03、雷公藤次堿(WR)與H亞基結(jié)合,通過(guò)擬合結(jié)合曲線計(jì)算得解離常數(shù)KD值分別為:253.0、144.0、156.0、164.0、186.0、203.0、59.0μM。經(jīng)過(guò)KD值與殺蟲毒力LD50及對(duì)V-ATPase活性抑制率的相關(guān)性分析知,二氫沉香呋喃多元酯類化合物的作用靶標(biāo)是V-ATPase H亞基。5.借助Discovery Studio軟件,采用同源建模法,以已知結(jié)構(gòu)的酵母H亞基為模型,構(gòu)建了東方粘蟲幼蟲中腸V-ATPase H亞基的模型,并預(yù)測(cè)了18個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)。利用分子對(duì)接技術(shù),將供試12個(gè)二氫沉香呋喃多元酯類化合物與H亞基模型對(duì)接,通過(guò)對(duì)接得分與KD值相關(guān)性分析可知,位于H亞基C端結(jié)構(gòu)域空腔內(nèi)的位點(diǎn)17(其氨基酸殘基為半光氨酸(Cys)、組氨酸(His)、色氨酸(Trp)、絲氨酸(Ser)、賴氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)等)為可能的作用位點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：二氫沉香呋喃多元酯 V-ATP酶 V-ATP酶H亞基 靶標(biāo)鑒定 靶標(biāo)驗(yàn)證 分子對(duì)接 東方粘蟲
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S482.3
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-41
• 1.1 新藥創(chuàng)制與靶標(biāo)創(chuàng)新15-18
• 1.1.1 糧食安全和環(huán)境安全需要不斷創(chuàng)制新農(nóng)藥15
• 1.1.2 我國(guó)農(nóng)藥創(chuàng)新現(xiàn)狀15-16
• 1.1.3 新農(nóng)藥創(chuàng)制的最新趨勢(shì)是基于化學(xué)蛋白組學(xué)分子靶標(biāo)導(dǎo)向的綠色農(nóng)藥創(chuàng)制16-18
• 1.2 V-ATPASE作為藥物靶標(biāo)的研究現(xiàn)狀18-34
• 1.2.1 V-ATPase的結(jié)構(gòu)與功能19-23
• 1.2.2 昆蟲V-ATPase23-27
• 1.2.3 V-ATPase抑制劑27-34
• 1.3 苦皮藤素V作用機(jī)理研究進(jìn)展34-38
• 1.3.1 苦皮藤素V的癥狀學(xué)研究35-36
• 1.3.2 苦皮藤素V對(duì)昆蟲部分酶系活性的影響36
• 1.3.3 苦皮藤素V的電生理研究36-37
• 1.3.4 苦皮藤素V選擇性作用機(jī)理研究37-38
• 1.4 論文設(shè)計(jì)思想38-41
• 1.4.1 選題背景、目的及科學(xué)意義38-39
• 1.4.2 研究?jī)?nèi)容39-40
• 1.4.3 研究技術(shù)路線40-41
• 第二章 結(jié)合蛋白的分離及鑒定41-50
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料41-42
• 2.1.1 試蟲41
• 2.1.2 供試化合物與試劑41
• 2.1.3 主要儀器41-42
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法42-45
• 2.2.1 連接配體的合成42-43
• 2.2.2 基于粘蟲幼蟲中腸刷狀緣膜囊泡（BBMV）的親和層析43-44
• 2.2.3 電泳檢測(cè)及結(jié)合蛋白的鑒定44-45
• 2.3 結(jié)果與分析45-47
• 2.3.1 連接配體的合成45
• 2.3.2 結(jié)合蛋白的洗脫45-46
• 2.3.3 電泳檢測(cè)與質(zhì)譜鑒定46-47
• 2.4 小結(jié)與討論47-50
• 第三章 二氫沉香呋喃多元酯類化合物對(duì)昆蟲V-ATPASE和氨肽酶活性的影響50-61
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料50-52
• 3.1.1 試蟲50
• 3.1.2 供試化合物50-51
• 3.1.3 主要試劑51-52
• 3.1.4 主要儀器52
• 3.1.5 主要緩沖液52
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法52-55
• 3.2.1 二氫沉香呋喃多元酯類化合物的殺蟲活性52-53
• 3.2.2 苦皮藤素V對(duì)氨肽酶N（APN）活性的影響53-54
• 3.2.3 二氫沉香呋喃多元酯類化合物對(duì)粘蟲中腸V-ATPase活性的影響54-55
• 3.3 結(jié)果與分析55-59
• 3.3.1 二氫沉香呋喃多元酯類化合物的殺蟲活性55-56
• 3.3.2 苦皮藤素V對(duì)氨肽酶（APN）活性的影響56-57
• 3.3.3 二氫沉香呋喃多元酯類化合物對(duì)粘蟲幼蟲中腸V-ATPase活性影響57-58
• 3.3.4 二氫沉香呋喃多元酯類化合物殺蟲活性與對(duì)V-ATPase活性抑制率的相關(guān)性分析58-59
• 3.4 小結(jié)與討論59-61
• 第四章 粘蟲V-ATPASE H亞基全長(zhǎng)CDNA克隆和表達(dá)分析61-79
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料61-62
• 4.1.1 試蟲61
• 4.1.2 主要試劑61
• 4.1.3 主要儀器61-62
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法62-69
• 4.2.1 粘蟲V-ATPase H亞基全長(zhǎng)cDNA的克隆62-68
• 4.2.2 粘蟲V-ATPase H亞基全長(zhǎng)cDNA序列的生物信息學(xué)分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建68
• 4.2.3 粘蟲中腸V-ATPase H亞基表達(dá)的生長(zhǎng)發(fā)育表達(dá)特征68-69
• 4.3 結(jié)果與分析69-77
• 4.3.1 粘蟲V-ATPase H亞基cDNA部分基因克隆69-71
• 4.3.2 粘蟲中腸V-ATPase H亞基cDNA的 3′RACE71-73
• 4.3.3 粘蟲中腸V-ATPase H亞基cDNA的 5'RACE73
• 4.3.4 粘蟲V-ATPase H亞基cDNA 3′和 5′RACE的序列驗(yàn)證73-75
• 4.3.5 序列分析75-76
• 4.3.6 粘蟲中腸V-ATPase H亞基表達(dá)的生長(zhǎng)發(fā)育表達(dá)特征76-77
• 4.4 小結(jié)與討論77-79
• 第五章 二氫沉香呋喃多元酯類化合物和粘蟲V-ATPASE H亞基的結(jié)合親和性分析79-96
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料79-80
• 5.1.1 試蟲79
• 5.1.2 菌株與表達(dá)載體79
• 5.1.3 主要試劑79-80
• 5.1.4 主要儀器80
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法80-84
• 5.2.1 粘蟲V-ATPase H亞基的原核表達(dá)80-82
• 5.2.2 粘蟲V-ATPase H亞基的純化82
• 5.2.3 二氫沉香呋喃多元酯類化合物和粘蟲V-ATPase H亞基蛋白的結(jié)合親和性與其胃毒活性和V-ATP酶抑制率的相關(guān)性分析82-84
• 5.3 結(jié)果與分析84-95
• 5.3.1 粘蟲V-ATPase H亞基的原核表達(dá)與純化84-90
• 5.3.2 二氫沉香呋喃多元酯類化合物和粘蟲V-ATPase H亞基蛋白的結(jié)合親和性與其胃毒活性和對(duì)V-ATP酶抑制率的相關(guān)性90-95
• 5.4 小結(jié)與討論95-96
• 第六章 東方粘蟲幼蟲中腸V-ATPASE H亞基同源模建及分子對(duì)接96-112
• 6.1 實(shí)驗(yàn)材料96-98
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法98-99
• 6.2.1 粘蟲V-ATPase H亞基模型的構(gòu)建98-99
• 6.2.2 二氫沉香呋喃多元酯類化合物與東方粘蟲幼蟲中腸V-ATPase H亞基的分子對(duì)接及結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)99
• 6.3 結(jié)果與分析99-111
• 6.3.1 目的蛋白序列與模板蛋白序列的比對(duì)99-100
• 6.3.2 3D模型的構(gòu)建100-101
• 6.3.3 模型評(píng)估101-103
• 6.3.4 粘蟲V-ATPase H亞基和二氫沉香呋喃多元酯類化合物活性位點(diǎn)確定及分子對(duì)接103-111
• 6.4 小結(jié)與討論111-112
• 第七章 討論與結(jié)論112-119
• 7.1 討論112-116
• 7.1.1 二氫沉香呋喃多元酯類殺蟲化合物的作用靶標(biāo)112-114
• 7.1.2 二氫沉香呋喃多元酯類殺蟲活性化合物的結(jié)合位點(diǎn)114
• 7.1.3 二氫沉香呋喃多元酯類殺蟲活性化合物的作用機(jī)理114-116
• 7.2 結(jié)論116-118
• 7.3 論文主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)118
• 7.4 尚需研究的問(wèn)題118-119
• 參考文獻(xiàn)119-131
• 附錄131-135
• 附錄1 化合物譜圖131-133
• 附錄2 緩沖液配制133-134
• 附錄3 縮略詞134-135
• 致謝135-136
• 作者簡(jiǎn)介136

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