本文關(guān)鍵詞：柑橘綠霉病菌比較基因組及抗DMI殺菌劑機理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：我國是世界上柑橘種植和消費的主要大國之一,柑橘年產(chǎn)量超過千萬噸。柑橘綠霉病一直以來是困擾柑橘儲藏、運輸和銷售環(huán)節(jié)的主要問題。在我國,每年因綠霉病導(dǎo)致的柑橘產(chǎn)量損失高達百萬噸。目前對柑橘綠霉病的防治手段捉襟見肘,病菌抗藥性產(chǎn)生的速率遠超藥劑更替的速率,對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全帶造成了嚴重的威脅。然而,由于對病菌的侵染過程和殺菌劑作用機理缺乏足夠的認識,如何有效提高病害的防治效果,同時減少對環(huán)境的傷害是我們目前所面臨的重大挑戰(zhàn)。本研究在此背景下,通過對柑橘綠霉病菌的全基因組測序,系統(tǒng)了解了病菌的遺傳組成,同時在獲得基因組信息的基礎(chǔ)上,闡明了我國柑橘綠霉病菌抗DMI殺菌劑主要菌群的抗性調(diào)控機理。研究結(jié)果如下： 1.柑橘綠霉病菌基因組測序揭示大量次生代謝及細胞壁水解酶等基因家族的丟失 通過全基因組測序,我們獲得了約26Mb的柑橘綠霉病菌基因組序列,包含103個scaffold。該基因組共編碼約9,000個蛋白和162個tRNA。重復(fù)序列約占整個基因組的1%。通過與其他青霉菌、曲霉菌以及近緣的植物病原真菌比較分析后發(fā)現(xiàn),柑橘綠霉病菌基因組更為緊湊,編碼相對較少的基因�；蚪M共線性和蛋白家族進化分析顯示,柑橘綠霉病菌有100多個家族發(fā)生了明顯的縮減,僅有兩個家族發(fā)生了擴增。通過對次生代謝物合成基因簇的預(yù)測,我們發(fā)現(xiàn)柑橘綠霉病菌中丟失了大部分毒素合成基因簇的關(guān)鍵合成基因,僅保留了一個完整的tryptoquialanine合成基因簇,這一結(jié)果解釋了前人研究發(fā)現(xiàn)柑橘綠霉病菌毒素合成能力較弱的現(xiàn)象,同時也預(yù)示毒素跟病菌的致病能力并不相關(guān)。通過碳氫化合物代謝相關(guān)酶的比較發(fā)現(xiàn),柑橘綠霉病菌丟失了大量的細胞壁水解酶,這也可能是導(dǎo)致該病菌寄主范圍較窄的原因之一。 2.線粒體基因組比較分析顯示柑橘綠霉病菌在進化過程了丟失了內(nèi)含子 通過基因組測序數(shù)據(jù)的拼接和實驗驗證,我們得到了柑橘綠霉病菌的全長線粒體基因組,該線粒體基因組大小為28,978bp,平均A+T含量為74.7%,共編碼15個蛋白,27個tRNA,以及兩個核糖體大、小亞基RNA基因。與酵母等物種相比,青霉屬真菌線粒體基因組雖然編碼能力(編碼基因數(shù))大致相當,但其編碼效率較高(80%為編碼序列)。青霉菌和曲霉菌的線粒體基因組比較分析發(fā)現(xiàn),這些菌中線粒體基因組的序列和編碼基因的排列都比較保守,其中atp8基因可能受到負選擇作用。此外,線粒體內(nèi)含子在所比較的幾個真菌中差異相對較大,而柑橘綠霉病菌在進化過程中可能丟失了一些內(nèi)含子。 3.比較轉(zhuǎn)錄組揭示柑橘綠霉病菌在碳源利用及PacC調(diào)控基因方面的差異 通過對柑橘綠霉病菌在柑橘皮和葡萄糖培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)錄組分析,我們發(fā)現(xiàn)在柑橘皮培養(yǎng)基上有290個基因發(fā)生了上調(diào)表達,而123個基因發(fā)生了下調(diào)表達。使用GO數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行功能注釋后發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要參與一些代謝過程。此外,很多參與碳源利用的基因都發(fā)生了上調(diào),如木酮糖還原酶,翻轉(zhuǎn)酶,幾丁質(zhì)酶,和β-N乙酰已糖胺酶等。相反,參與氨基酸、核苷酸代謝的這些基因大多都沒有發(fā)生差異表達。另外,部分細胞壁水解酶以及tryptoquialanine的整個合成基因都發(fā)生了上調(diào)表達。 柑橘綠霉病菌和膠孢炭疽菌都能夠侵染柑橘果實,然而兩者采取截然不同的策略,前者在侵染的時候能夠產(chǎn)生有機酸使環(huán)境酸化,而后者則分泌胺類物質(zhì)使環(huán)境堿化。通過對這兩個真菌中PacC突變體的表達譜分析后發(fā)現(xiàn),產(chǎn)酸和產(chǎn)堿真菌中PacC的調(diào)控機理已經(jīng)發(fā)生了較為明顯的分化,盡管識別的模體和調(diào)控的基因家族相對保守,但是對于特定基因的調(diào)控方式(上調(diào)或下調(diào))以及表達量差異明顯,產(chǎn)堿真菌中盡管被抑制的基因和被激活的基因數(shù)目相當,但是堿性表達基因在PacC激活情況下表達量有很強的優(yōu)勢。而產(chǎn)酸真菌中,大量的基因在堿性條件下被抑制表達,但當病菌生長過程中,環(huán)境pH不斷降低,這些基因?qū)㈥懤m(xù)被激活,從而參與生長和致病過程。 4. PdCYP51B基因的超量表達是造成柑橘綠霉病菌抗DMI殺菌劑的原因 在2000年到2010年期間,我們在浙江省主要柑橘產(chǎn)區(qū)收集了403個柑橘綠霉病菌菌株,其中,高達89%的抗性菌株其抗性機理不明。為此,我們比較了不同的抗性和敏感菌株,發(fā)現(xiàn)柑橘綠霉病菌中存在另外兩個相似度較高的CYP51基因,稱之為PdCYP51B和PdCYP51C。進一步分析發(fā)現(xiàn)在未知抗性菌株中,PdCYP51B啟動子區(qū)都含有一段199bp序列的插入,這個特征在抑霉唑敏感菌株和已知抗性基因型的菌株中均不存在。將敏感菌株中的PdCYP51B基因轉(zhuǎn)入柑橘綠霉病菌后,突變體的抗藥性增加,而將含有199bp序列插入的PdCYP51B基因轉(zhuǎn)入病菌后,突變體的抗藥性增加更高。說明,199bp序列的插入造成了PdCYP51B基因的超量表達,從而賦予了病菌對藥劑的抗性。 5.199bp插入片段是一個具有轉(zhuǎn)座和啟動子活性的微小轉(zhuǎn)座子 對上述199bp插入片段進行序列分析,我們發(fā)現(xiàn)了一個TSD (target site duplication)和一個TIR (terminal invert repeat)位點。此外,該序列無編碼能力,能夠形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu),且富含A+T�；谝陨戏治�,我們認為該199bp屬于微小轉(zhuǎn)座子家族(miniature inverted-repeat transposable element, MITE),命名為PdMLEl。數(shù)據(jù)庫搜索和Southern雜交顯示,PdMLEl僅存在于柑橘綠霉病菌中,且拷貝數(shù)較多。GFP融合表達顯示,PdMLEl能夠啟動GFP表達,且啟動子能力較強。通過對PdMLEl核心啟動子序列定位,我們得到了一段20bp的啟動子核心區(qū)域,同時我們也通過類似的方法獲得了PdCYP51B基因原始啟動子的核心區(qū)域,綜合以上信息,我們提出了一個轉(zhuǎn)座子影響病菌抗藥性的調(diào)控模型。 以上五部分內(nèi)容的研究相輔相成,不僅揭示了柑橘綠霉病菌抗藥性的產(chǎn)生和調(diào)控機理,同時更多的是揭示了柑橘綠霉病菌的基因組遺傳信息,給后續(xù)深入理解病菌其他方面的分子機理提供了研究基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：柑橘綠霉病菌 基因組測序 轉(zhuǎn)錄組測序 抗藥性 植物病原真菌 轉(zhuǎn)座子 調(diào)控模型
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S436.66
【目錄】：

• 致謝7-11
• 摘要11-14
• Abstract14-18
• 第一章 緒論18-31
• 1.1 課題背景18-19
• 1.2 病原真菌侵染果實過程和互作機制19-24
• 1.2.1 病原真菌侵染和定殖的過程19-20
• 1.2.2 果皮對真菌侵染和定殖的影響20-21
• 1.2.3 果實防衛(wèi)反應(yīng)的影響21-22
• 1.2.4 有關(guān)果實病原真菌致病機制的研究22-24
• 1.3 柑橘綠霉病化學(xué)防治及病菌抗藥性研究24-29
• 1.3.1 DMI殺菌劑的作用機理25
• 1.3.2 DMI殺菌劑抗性產(chǎn)生及其機理25-27
• 1.3.3 靶標基因上調(diào)表達機理27-28
• 1.3.4 柑橘綠霉病菌抗DMI殺菌劑新型分子機理28-29
• 1.4 高通量測序在揭示病菌致病機理中的應(yīng)用29-30
• 1.5 本研究的目的和意義30-31
• 第二章 柑橘綠霉病菌基因組測序和比較基因組分析31-51
• 2.1 引言31
• 2.2 材料和方法31-34
• 2.2.1 菌株及培養(yǎng)條件31-32
• 2.2.2 DNA提取及基因組測序、組裝32
• 2.2.3 基因預(yù)測及注釋32-33
• 2.2.4 基因組共線性、直系同源基因和進化分析33
• 2.2.5 蛋白家族分類與進化分析33
• 2.2.6 分泌蛋白預(yù)測33-34
• 2.2.7 次級代謝物合成基因簇預(yù)測34
• 2.2.8 在線數(shù)據(jù)34
• 2.3 結(jié)果與討論34-49
• 2.3.1 柑橘綠霉病菌形態(tài)及侵染循環(huán)34-35
• 2.3.2 柑橘綠霉病菌基因組特征35-37
• 2.3.3 青霉屬直系同源基因比較37-40
• 2.3.4 柑橘綠霉病菌與其他真菌基因組共線性比較40-41
• 2.3.5 柑橘綠霉病菌致病相關(guān)基因41-43
• 2.3.6 柑橘綠霉病菌細胞壁水解酶43-46
• 2.3.7 柑橘綠霉病菌毒素合成46-47
• 2.3.8 柑橘綠霉病菌ABC轉(zhuǎn)運蛋白47-49
• 2.4 本章小結(jié)49-51
• 第三章 柑橘綠霉病菌線粒體基因組51-59
• 3.1 引言51
• 3.2 材料與方法51-52
• 3.2.1 菌株、培養(yǎng)條件、基因組測序51-52
• 3.2.2 生物信息學(xué)分析52
• 3.3 結(jié)果與討論52-57
• 3.3.1 線粒體基因特征52
• 3.3.2 線粒體蛋白編碼基因52-55
• 3.3.3 線粒體內(nèi)含子及內(nèi)含子基因55-57
• 3.3.4 線粒體tRNA基因57
• 3.3.5 線粒體rRNA基因57
• 3.4 本章小結(jié)57-59
• 第四章 柑橘綠霉病菌比較轉(zhuǎn)錄組研究59-73
• 4.1 引言59-60
• 4.2 材料與方法60-61
• 4.2.1 菌株與培養(yǎng)條件60
• 4.2.2 文庫制備和數(shù)據(jù)分析60-61
• 4.3 結(jié)果與討論61-70
• 4.3.1 不同培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)錄組差異61-66
• 4.3.2 不同真菌之間PacC調(diào)控差異66-70
• 4.4 本章小結(jié)70-73
• 第五章 柑橘綠霉病菌抗DMI殺菌劑新基因型的發(fā)現(xiàn)73-92
• 5.1 引言73
• 5.2 材料與方法73-80
• 5.2.1 菌株、材料及培養(yǎng)方法73-74
• 5.2.2 培養(yǎng)基74-75
• 5.2.3 試劑75-76
• 5.2.4 引物序列76-77
• 5.2.5 抑霉唑抗性表型和基因型檢測77
• 5.2.6 PdCYP51B和PdCYP51C基因的克隆和序列分析77
• 5.2.7 實時定量PCR77-78
• 5.2.8 過表達載體構(gòu)建78
• 5.2.9 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化78-79
• 5.2.10 Southern雜交79-80
• 5.2.11 PCR方法檢測柑橘綠霉病菌抗性基因型80
• 5.3 結(jié)果與討論80-89
• 5.3.1 柑橘綠霉病菌對抑霉唑抗性及抗性基因型80-81
• 5.3.2 CYP51同源基因的克隆81-82
• 5.3.3 PdCYP51B啟動子區(qū)含有199bp序列插入82-84
• 5.3.4 199bp插入序列的生物信息學(xué)分析84
• 5.3.5 PdCYP51B基因在IMZ-R3菌株中超量表達84-85
• 5.3.6 PdCYP51同源基因均能被抑霉唑誘導(dǎo)85-86
• 5.3.7 過表達PdCYP51B基因降低病菌對抑霉唑的敏感性86-87
• 5.3.8 基于雙重PCR的DMI抗性基因型檢測87-89
• 5.4 本章小結(jié)89-92
• 第六章 柑橘綠霉病菌抗DMI殺菌劑新基因型的調(diào)控機理92-103
• 6.1 引言92-93
• 6.2 材料與方法93-94
• 6.2.1 菌株和培養(yǎng)方法93
• 6.2.2 載體構(gòu)建93
• 6.2.3 啟動子定位93-94
• 6.2.4 Southern雜交94
• 6.2.5 生物信息學(xué)分析94
• 6.3 結(jié)果與討論94-101
• 6.3.1 199bp插入序列是一個轉(zhuǎn)座子94-95
• 6.3.2 PdMLE1特異且廣泛的存在于柑橘綠霉病菌中95-96
• 6.3.3 PdMLE1是一個強啟動子96-97
• 6.3.4 PdMLE1和PdCYP51B核心啟動子區(qū)定位97-99
• 6.3.5 PdMLE1的全基因組插入位點分析99-101
• 6.4 本章小結(jié)101-103
• 第七章 全文總結(jié)103-107
• 7.1 柑橘綠霉病菌基因組測序及比較基因組研究103-104
• 7.2 柑橘綠霉病菌抗藥性研究104-105
• 7.3 全文創(chuàng)新點105-106
• 7.4 全文不足之處106
• 7.5 今后的研究方向106-107
• 參考文獻107-119
• 附錄119-127
• 研究生期間發(fā)表論文127-128

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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  本文關(guān)鍵詞：柑橘綠霉病菌比較基因組及抗DMI殺菌劑機理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：381130