黃瓜(Cucumis sativus)是我國設(shè)施栽培中主要的蔬菜作物之一。多主棒孢(Corynespora cassiicola)是重要的蔬菜傳染性病原真菌,可引起黃瓜棒孢葉斑病,嚴(yán)重危害黃瓜的生產(chǎn)。目前關(guān)于黃瓜對棒孢葉斑病的抗性機(jī)制研究甚少。實(shí)驗(yàn)室前期通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在棒孢葉斑病侵染早期,黃瓜兩個(gè)白粉病抗性基因(Mildew Resistance Locus O,MLO)CsMLO1(Cucsa.207280)和CsMLO2(Cucsa.308270)的蛋白與基因表達(dá)水平均出現(xiàn)明顯上調(diào)。本論文研究了CsMLO1和CsMLO2基因表達(dá)特性與黃瓜應(yīng)答棒孢葉斑病菌侵染的關(guān)系,通過基因瞬時(shí)沉默和過量表達(dá)初步揭示CsMLO1和CsMLO2基因在黃瓜響應(yīng)棒孢葉斑病菌侵染中的作用;同時(shí),利用酵母雙雜交、螢火蟲熒光素酶(LCI)互補(bǔ)系統(tǒng)和雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)系統(tǒng)等技術(shù),篩選到與其CsMLO1和CsMLO2發(fā)生相互作用的蛋白,探討了CsMLO1和CsMLO2在調(diào)控黃瓜抗棒孢葉斑中的作用機(jī)制。本研究將為揭示黃瓜與棒孢葉斑病菌之間相互作用的分子機(jī)制提供依據(jù),并將有利于更深入、精...

【文章頁數(shù)】：145 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 黃瓜棒孢葉斑病
        1.1.1 黃瓜棒孢葉斑病的發(fā)生及危害
        1.1.2 黃瓜棒孢葉斑病病癥及特點(diǎn)
        1.1.3 黃瓜棒孢葉斑病菌的遺傳多樣性和生理分化
        1.1.4 黃瓜棒孢葉斑病的防治方法
        1.1.5 黃瓜棒孢葉斑病抗性遺傳規(guī)律的研究
    1.2 植物抗病性研究
    1.3 植物MLO研究
        1.3.1 MLO基因家族
        1.3.2 植物 MLO 結(jié)構(gòu)特征
        1.3.3 MLO基因定位及表達(dá)模式
        1.3.4 MLO基因功能
        1.3.5 mlo介導(dǎo)的抗性機(jī)制
    1.4 本研究的目的和意義
    1.5 技術(shù)路線
第二章 黃瓜CsMLO1和CsMLO2 基因的克隆、定位及表達(dá)分析
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株及載體
        2.1.3 試劑配制
        2.1.4 引物合成及測序
    2.2 方法
        2.2.1 DNA和 RNA的提取及c DNA合成
        2.2.2 CsMLO1和CsMLO2 啟動(dòng)子和基因全長克隆
        2.2.3 亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建
        2.2.4 煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)和原生質(zhì)體提取
        2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)
        2.2.6 激光共聚焦掃描顯微鏡的觀察
        2.2.7 目的基因的生物信息學(xué)分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 CsMLO1和CsMLO2 基因全長和啟動(dòng)子的獲得和分析
        2.3.2 CsMLO1和CsMLO2 基因生物信息學(xué)分析
        2.3.3 CsMLO1和CsMLO2 的亞細(xì)胞定位分析
        2.3.4 CsMLO1和CsMLO2 基因表達(dá)特異性分析
        2.3.5 不同外源物質(zhì)處理下黃瓜CsMLO1和CsMLO2 的基因表達(dá)分析
    2.4 討論
    2.5 本章小結(jié)
第三章 CsMLO1和CsMLO2 在黃瓜抗棒孢葉斑病中的作用
    3.1 材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株及載體
        3.1.3 試劑配制
        3.1.4 引物合成及測序
    3.2 方法
        3.2.1 棒孢葉斑病菌活化與侵染
        3.2.2 黃瓜病情指數(shù)調(diào)查
        3.2.3 RNA的提取及c DNA合成
        3.2.4 CsMLO1和CsMLO2 基因瞬時(shí)過表達(dá)載體構(gòu)建
        3.2.5 CsMLO1和CsMLO2 基因沉默表達(dá)載體構(gòu)建
        3.2.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化黃瓜子葉
        3.2.7 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化黃瓜子葉后組織化學(xué)染色
        3.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 棒孢葉斑病菌脅迫下CsMLO1和CsMLO2 的基因表達(dá)分析
        3.3.2 CsMLO1和CsMLO2 基因瞬時(shí)過表達(dá)載體獲得
        3.3.3 CsMLO1和CsMLO2 基因沉默表達(dá)載體獲得
        3.3.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌檢測
        3.3.5 CsMLO1和CsMLO2 基因瞬時(shí)過表黃瓜子葉鑒定
        3.3.6 CsMLO1和CsMLO2 基因瞬時(shí)沉默黃瓜子葉鑒定
        3.3.7 瞬時(shí)過表達(dá)CsMLO1和CsMLO2 基因黃瓜子葉的棒孢葉斑病抗性鑒定
        3.3.8 瞬時(shí)沉默CsMLO1和CsMLO2 基因黃瓜子葉的棒孢葉斑病抗性鑒定
        3.3.9 CsMLO1和CsMLO2 基因?qū)Σ〕滔嚓P(guān)基因的調(diào)控表達(dá)
    3.4 討論
    3.5 本章小結(jié)
第四章 CsMLO1和CsMLO2 在黃瓜抗棒孢葉斑病中的作用機(jī)制
    4.1 材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 菌株及載體
        4.1.3 試劑配制
        4.1.4 引物合成及測序
    4.2 方法
        4.2.1 棒孢葉斑病菌活化與侵染
        4.2.2 黃瓜病情指數(shù)調(diào)查
        4.2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化黃瓜子葉相關(guān)基因表達(dá)檢測、抗性相關(guān)酶活及內(nèi)源ABA含量測定
        4.2.4 酵母雙雜交試驗(yàn)
        4.2.5 螢火蟲熒光素酶互補(bǔ)(LCI)試驗(yàn)
        4.2.6 蛋白表達(dá)檢測
        4.2.7 雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)試驗(yàn)
        4.2.8 煙草葉片表皮細(xì)胞中CsMLO1和CsCaM3 共定位試驗(yàn)
        4.2.9 黃瓜子葉中共表達(dá)CsMLO1和CsCaM3 觸發(fā)的防衛(wèi)反應(yīng)試驗(yàn)
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 CsMLO1和CsMLO2 基因參與調(diào)控的抗病信號途徑
        4.3.2 CsMLO1和CsMLO2 通過鈣調(diào)素信號介導(dǎo)黃瓜的防衛(wèi)反應(yīng)
    4.4 討論
    4.5 本章小結(jié)
全文總結(jié)與展望
本論文的特色和創(chuàng)新之處
參考文獻(xiàn)
附錄
縮略詞
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文
申請專利



本文編號：3788327