本文關鍵詞：植物MAPK級聯(lián)途徑基因家族的進化分析及番茄SlMPK13的功能鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPK)級聯(lián)途徑是存在于真核生物中的高度保守的信號轉(zhuǎn)導途徑之一。典型的MAPK級聯(lián)途徑由三種蛋白激酶組成,即MAPK (MPK)、MAPKK (MKK、MEK)和MAPKKK (MEKK),并通過MAPKKK-MAPKK-MAPK依次磷酸化作用將信號傳遞放大。MAPK級聯(lián)途徑在植物生長發(fā)育及多種逆境響應中起重要作用。本研究從全基因組水平對兩種重要蔬菜作物,番茄和黃瓜中的MAPK級聯(lián)途徑基因家族成員進行鑒定,并對它們的分類、保守結構域、基因結構、表達特征等進行了分析。同時利用生物信息學方法分析了MAPK級聯(lián)途徑相關基因家族在植物中的分布及進化關系。為進一步探究MAPK基因在番茄生長發(fā)育過程中的功能,在分離番茄雄蕊優(yōu)勢表達基因SIMPK13的基礎上,我們進行了亞細胞定位、蛋白質(zhì)體外原核表達、體外磷酸化活性以及表達特征分析。隨后利用RNA干擾(RNAi)技術研究了SlMPK13在番茄營養(yǎng)生長、花器官形態(tài)發(fā)育及花粉發(fā)育中的功能,并利用RNA-seq技術探索了其在花粉發(fā)育中的作用機制。主要研究結果如下：(1)利用同源比對和HMMER搜索,在番茄基因組中共鑒定了89個MAPKKKs、5個MAPKKs和1個新的MAPK基因；在黃瓜基因組中共鑒定了59個MAPKKKs、6個MAPKKs和14個MAPKs。多序列比對、保守基序和系統(tǒng)進化分析結果表明,植物MAPK和MAPKK基因家族分為A、B、C、D四個亞組,而MAPKKK基因家族則分為MEKK、RAF和ZIK三個亞組。實時熒光定量PCR (qRT-PCR)分析結果顯示,多數(shù)番茄和黃瓜MAPK級聯(lián)途徑基因在多個植物器官中普遍表達,且參與多種逆境脅迫和激素的響應過程。(2)進化分析顯示,MAPKKK家族的基因數(shù)目在不同植物中差異很大；植物MAPKKK家族在藻類植物進化以前就已完成三個亞族的分化；隨著進化歷程的演變,植物MAPKKK家族主要發(fā)生了兩次基因數(shù)目的迅速擴增,分別發(fā)生在藻類植物到苔蘚植物以及蕨類植物到開花植物的進化過程中,且植物MAPKKK基因數(shù)目的大量擴增主要發(fā)生在RAF亞族內(nèi)。植物MAPKK家族A、B兩個亞組的基因起源較早,在藻類植物中就已經(jīng)存在；而C、D亞組MAPKK基因成員直到開花植物才出現(xiàn)。植物MAPK基因家族的迅速擴增發(fā)生在蕨類植物到開花植物的進化過程中,且主要發(fā)生在D亞組內(nèi)；C、D兩個亞組MAPK基因起源于藻類植物進化以前,A、B亞組的MAPK基因在苔蘚植物中也已出現(xiàn)。(3) QRT-PCR及原位雜交結果表明,SlMPK13在番茄植株的多個器官/組織以及雄蕊的不同發(fā)育時期中都有表達,但在開放花的雄蕊中尤其是成熟花粉中優(yōu)勢表達。體外原核表達表明,SlMPK13編碼一個大小約為44 kDa的水溶蛋白。將該蛋白與磷酸化的酪氨酸抗體進行Western雜交,結果顯示其具有體外磷酸化的活性；亞細胞定位結果顯示,SlMPK13定位在細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核中。(4)構建了花椰菜花葉病毒CaMV35S組成型啟動子啟動的RNA干擾載體p35S::slmpkl3-RNAi,并利用“葉盤法”遺傳轉(zhuǎn)化番茄品種'Micro-Tom'。觀察轉(zhuǎn)基因后代發(fā)現(xiàn),植株表現(xiàn)出生長矮小、葉片發(fā)育畸形、根發(fā)育受抑制、花器官異常肥大、雄蕊頂端開裂等多種表現(xiàn)型。以上結果表明,SlMPK13在番茄營養(yǎng)生長與生殖發(fā)育過程中的功能具有多效性。(5)為特異地研究SlMPK13在番茄花粉發(fā)育中的功能,我們構建了花粉特異啟動子LAT52啟動的RNAi載體pLAT52::slmpkl3-RNAi。對花粉進行表型觀察發(fā)現(xiàn),超過50%的轉(zhuǎn)基因花粉畸形,花粉生活力及萌發(fā)率下降,花粉育性顯著降低,番茄的座果率以及單果種子數(shù)目顯著下降�；ǚ奂毎麑W觀察與DAPI染色結果顯示,在小孢子發(fā)育的雙核早期及其以前的幾個時期,pLAT52::slmpkl3-RNAi轉(zhuǎn)基因花粉發(fā)育正常,營養(yǎng)核及生殖核正�？梢姟ｋp核大液泡時期以后,花粉細胞膜開始呈現(xiàn)不規(guī)則凹陷及破損,液泡數(shù)目增多。隨著花粉成熟,液泡體積變大,細胞內(nèi)容物逐漸降解,最終形成皺縮干癟的花粉粒。(6)利用RNA-seq技術比較了pLAT52::slmpkl3-RNAi轉(zhuǎn)基因與對照雄蕊在不同發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組基因表達的變化。結果發(fā)現(xiàn),雄蕊發(fā)育早期差異表達基因數(shù)量極少,而雄蕊發(fā)育后期有1077個差異表達基因,其中846個上調(diào)表達,231個下調(diào)表達�；虮倔w論(Gene Othology, GO)和生物學代謝途徑(pathway)分析顯示,大多數(shù)差異表達基因參與“碳水化合物代謝”、“細胞元件形成”、“信號傳導”、“細胞凋亡”等生物學過程。結合細胞學觀察及亞細胞定位結果,我們推測,抑制SIMPK13的表達可能在花粉發(fā)育晚期啟動了花粉細胞凋亡,使得細胞膜及液泡發(fā)育異常,細胞內(nèi)碳水化合物或脂類代謝異常,從而影響成熟花粉的形成。
【關鍵詞】：
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S641.2
【目錄】：

• 致謝8-13
• 縮略詞13-15
• 摘要15-17
• Abstract17-20
• 前言20-23
• 1 文獻綜述23-36
• 1.1 MAPK級聯(lián)途徑23-26
• 1.1.1 基本組成23
• 1.1.2 植物MAPKKK23-24
• 1.1.3 植物MAPKK24-25
• 1.1.4 植物MAPK25-26
• 1.2 植物MAPK級聯(lián)途徑的生物學功能26-33
• 1.2.1 在植物生長發(fā)育中的作用26-29
• 1.2.1.1 在細胞分裂中的作用27-28
• 1.2.1.2 在細胞分化及發(fā)育中的作用28
• 1.2.1.3 在植物生殖發(fā)育中的作用28-29
• 1.2.1.4 在植物衰老和器官脫落中的作用29
• 1.2.2 在植物響應生物脅迫中的作用29-31
• 1.2.3 在植物響應非生物脅迫中的作用31-33
• 1.3 植物MAPK的下游作用因子33-35
• 1.4 番茄MAPK級聯(lián)途徑的研究進展35-36
• 2 植物MAPK級聯(lián)途徑基因家族的進化及相關基因的表達分析36-83
• 2.1 材料與方法37-40
• 2.1.1 試驗材料37
• 2.1.2 試驗試劑37
• 2.1.3 植物MAPK、MAPKK、MAPKKK家族成員鑒定37-38
• 2.1.4 植物MAPK級聯(lián)途徑家族基因序列特征分析38
• 2.1.5 苗期逆境脅迫處理38-39
• 2.1.6 植物MAPK級聯(lián)途徑家族基因的表達分析39-40
• 2.1.6.1 植物總RNA的提取反轉(zhuǎn)錄合成cDNA39
• 2.1.6.2 熒光實時定量PCR39-40
• 2.2 結果與分析40-81
• 2.2.1 植物MAPKKK基因家族成員的鑒定及進化分析40-62
• 2.2.1.1 番茄MAPKKK基因的鑒定及表達特征分析40-49
• 2.2.1.2 黃瓜MAPKKK基因家族成員的鑒定及表達分析49-56
• 2.2.1.3 植物MAPKKK基因家族的進化分析56-62
• 2.2.2 植物MAPKK基因家族成員的鑒定及進化分析62-72
• 2.2.2.1 番茄MAPKK基因家族成員的鑒定及表達分析62-66
• 2.2.2.2 黃瓜MAPKK基因家族成員的鑒定及表達分析66-69
• 2.2.2.3 植物MAPKK基因家族的進化分析69-72
• 2.2.3 植物MAPK基因家族成員的鑒定及進化分析72-81
• 2.2.3.1 番茄MAPK基因家族成員的鑒定及表達分析72-74
• 2.2.3.2 黃瓜MAPK基因家族成員的鑒定及表達分析74-78
• 2.2.3.3 植物MAPK基因家族的進化分析78-81
• 2.3 討論81-83
• 2.3.1 植物MAPKKK基因家族的進化81
• 2.3.2 植物MAPKK基因家族的進化81-82
• 2.3.3 植物MAPK基因家族的進化82-83
• 3 番茄SlMPK13的表達特征及所編碼蛋白質(zhì)的基本特性分析83-99
• 3.1 材料與方法84-91
• 3.1.1 試驗材料84
• 3.1.2 試驗試劑84
• 3.1.3 SlMPK13的時空表達特性分析84-88
• 3.1.3.1 QRT-PCR分析84-85
• 3.1.3.2 植物組織原位雜交分析85-88
• 3.1.4 SlMPK13的基本特性分析88-91
• 3.1.4.1 原核表達分析88-90
• 3.1.4.2 蛋白SDS-PAGE電泳及Western Blot印跡90
• 3.1.4.3 SlMPK13的亞細胞定位90-91
• 3.2 結果與分析91-97
• 3.2.1 SlMPK13在番茄開放花的雄蕊中優(yōu)勢表達91-94
• 3.2.2 SlMPK13的磷酸化性質(zhì)分析94-95
• 3.2.3 SlMPK13的亞細胞定位95-97
• 3.3 討論97-99
• 3.3.1 SlMPK13是一個在成熟花藥中優(yōu)勢表達的重要基因97
• 3.3.2 SlMPK13定位于細胞各部位并具有MPK激酶活性97-99
• 4 番茄SlMPK13在花粉發(fā)育中的功能鑒定99-127
• 4.1 材料方法100-107
• 4.1.1 試驗材料與試驗試劑100
• 4.1.2 RNAi載體的構建100-101
• 4.1.2.1 正義片段和反義片段序列擴增100
• 4.1.2.2 CaMV35S組成型啟動子的RNAi載體構建100-101
• 4.1.2.3 番茄花粉特異啟動子LAT52的RNAi載體構建101
• 4.1.3 RNAi載體對番茄植株的遺傳轉(zhuǎn)化101-103
• 4.1.3.1 農(nóng)桿菌菌株的獲得與侵染菌液制備101-102
• 4.1.3.2 番茄無菌苗的培養(yǎng)102
• 4.1.3.3 番茄植株的遺傳轉(zhuǎn)化102-103
• 4.1.4 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測103-104
• 4.1.4.1 PCR檢測103-104
• 4.1.4.2 GUS組織化學染色104
• 4.1.4.3 QRT-PCR檢測104
• 4.1.5 轉(zhuǎn)基因番茄植株的表型觀察104-107
• 4.1.5.1 轉(zhuǎn)基因番茄植株的形態(tài)觀察104-105
• 4.1.5.2 花粉生活力觀察105-106
• 4.1.5.3 花粉形態(tài)掃描電鏡觀察106
• 4.1.5.4 花粉半薄切片觀察106
• 4.1.5.5 花粉形態(tài)超薄透射電鏡觀察106-107
• 4.2 結果與分析107-124
• 4.2.1 抑制SlMPK13表達對番茄營養(yǎng)生長的影響107-111
• 4.2.2 抑制SlMPK13表達對番茄花器官的影響111-113
• 4.2.3 SlMPK13組織特異性抑制表達對番茄花粉發(fā)育及坐果的影響113-119
• 4.2.4 抑制SlMPK13表達對花粉超微結構的影響119-124
• 4.3 討論124-127
• 4.3.1 SlMPK13在番茄生長發(fā)育過程中的作用存在多效型124-125
• 4.3.2 SlMPK13在番茄花粉發(fā)育過程中起重要作用125-126
• 4.3.3 SlMPK13通過影響細胞膜和液泡的變化而影響番茄花粉發(fā)育126-127
• 5 抑制SlMPK13的表達對番茄轉(zhuǎn)錄組水平的影響127-139
• 5.1 材料與方法128-130
• 5.1.1 試驗材料與試驗試劑128
• 5.1.2 植物總RNA提取及質(zhì)量檢測128
• 5.1.3 轉(zhuǎn)錄組文庫的構建及測序128-129
• 5.1.4 測序數(shù)據(jù)處理129-130
• 5.2 結果與分析130-137
• 5.2.1 差異基因的鑒定130-132
• 5.2.2 差異表達基因的基因本體論分析132-134
• 5.2.3 差異表達基因的生物學代謝途徑分析134-137
• 5.3 討論137-139
• 5.3.1 轉(zhuǎn)錄組測序研究MAPK下游作用因子的可行性137
• 5.3.2 SlMPK13在番茄花粉成熟過程中的調(diào)控機制推測137-139
• 結論139-141
• 參考文獻141-157
• 附表157-186
• 博士在讀期間發(fā)表的論文186

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 安新民,張上隆,徐昌杰;柑桔轉(zhuǎn)化酶基因家族新成員的克隆和序列分析[J];上海交通大學學報(農(nóng)業(yè)科學版);2003年01期

2 牛艷梅;沈文濤;周鵬;;Expansin超級家族的進化與命名[J];廣東農(nóng)業(yè)科學;2007年08期

3 魏云虎;張煜s，

本文編號：377716