骨骼肌作為哺乳動物體重占比最高的組織,其生長發(fā)育直接影響畜牧業(yè)產(chǎn)肉效率,因此對骨骼肌細(xì)胞增殖分化的調(diào)控研究尤為重要。多項研究表明,mi RNAs與骨骼肌生長發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)。然而,mi RNAs在這一過程中發(fā)揮的具體機制,如控制自身轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件、調(diào)控骨骼肌生長發(fā)育的關(guān)鍵作用通路等,仍然有待探究。本研究以C2C12成肌細(xì)胞為模型,運用染色質(zhì)可及性及高通量測序（Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing,ATAC-seq）和染色質(zhì)免疫共沉淀及高通量測序（Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing,Ch IP-seq）等表觀遺傳學(xué)策略,解析細(xì)胞成肌分化過程中mi RNAs基因自身表達(dá)的調(diào)控機制。通過轉(zhuǎn)錄組分析策略和功能驗證全面探究了mi RNAs調(diào)控細(xì)胞成肌分化的關(guān)鍵分子途徑。另外,初步繪制了mi RNAs在豬骨骼肌不同發(fā)育時期的時序表達(dá)特征。本研究主要結(jié)果如下:（1）建立了C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)成肌模型,在細(xì)胞分化0D、1D、2D和4D不同時間點... 

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表(ABBREVIATIONS)
1 前言
    1.1 研究問題的由來
    1.2 文獻(xiàn)綜述
        1.2.1 骨骼肌發(fā)育及成肌細(xì)胞分化的研究進(jìn)展
        1.2.2 MicroRNAs調(diào)控成肌細(xì)胞分化的研究進(jìn)展
        1.2.3 Hippo信號通路在成肌細(xì)胞分化中的作用
        1.2.4 MAPK/Erk信號通路與成肌細(xì)胞分化相關(guān)研究進(jìn)展
        1.2.5 哺乳動物基因組調(diào)控元件鑒定進(jìn)展
        1.2.6 MicroRNAs調(diào)控元件的研究進(jìn)展
    1.3 研究目的和意義
2 材料與方法
    2.1 技術(shù)路線
    2.2 實驗材料
        2.2.1 細(xì)胞系、載體和菌株
        2.2.2 主要試劑及設(shè)備
    2.3 實驗方法
        2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.3.2 核酸提取及檢測
        2.3.3 RNA反轉(zhuǎn)錄及檢測
        2.3.4 實時熒光定量PCR(Q-PCR)
        2.3.5 細(xì)胞免疫熒光
        2.3.6 蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(Western Blotting)
        2.3.7 siRNA轉(zhuǎn)染
        2.3.8 雙熒光素酶報告基因
        2.3.9 構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9敲低細(xì)胞系
        2.3.10 細(xì)胞ATAC-seq
        2.3.11 Agilent質(zhì)控
        2.3.12 miRNA測序
        2.3.13 mRNA測序
        2.3.14 高通量數(shù)據(jù)分析
3 結(jié)果
    3.1 成肌分化不同時期差異表達(dá)miRNAs
        3.1.1 C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)成肌四個時間點的分化模型建立
        3.1.2 成肌細(xì)胞RNA質(zhì)量檢測
        3.1.3 成肌細(xì)胞誘導(dǎo)成肌不同階段miRNAs測序數(shù)據(jù)比對
        3.1.4 C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)成肌過程中差異miRNAs表達(dá)分析
    3.2 細(xì)胞成肌分化過程中miRNAs差異表達(dá)的調(diào)控因子
        3.2.1 C2C12細(xì)胞ATAC-seq文庫構(gòu)建
        3.2.2 C2C12細(xì)胞ATAC-seq數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測
        3.2.3 差異表達(dá)miRNAs調(diào)控區(qū)域可視化分析
        3.2.4 差異表達(dá)miRNAs的染色質(zhì)開放區(qū)域調(diào)控研究
        3.2.5 調(diào)控miRNAs差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子鑒定
    3.3 成肌分化過程中差異miRNAs靶基因及功能富集分析
        3.3.1 成肌分化過程中差異miRNAs靶基因預(yù)測
        3.3.2 成肌分化過程中差異miRNAs功能富集分析
    3.4 miRNAs參與Hippo通路調(diào)控成肌分化的潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
        3.4.1 miRNAs協(xié)同參與Hippo信號通路的潛在網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建
        3.4.2 miRNAs靶基因的雙熒光素酶報告基因載體系統(tǒng)驗證
    3.5 Hippo信號通路調(diào)控細(xì)胞成肌分化的研究
        3.5.1 利用siRNA抑制Hippo信號通路效應(yīng)因子Yap1表達(dá)
        3.5.2 利用siRNA抑制Hippo信號通路效應(yīng)因子Wwtr1表達(dá)
        3.5.3 利用慢病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)抑制Wwtr1表達(dá)
        3.5.4 抑制Hippo信號通路對細(xì)胞成肌分化的影響
    3.6 miRNAs參與MAPK/Erk信號通路調(diào)控成肌分化的潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
    3.7 豬骨骼肌發(fā)育過程miRNAs時序表達(dá)規(guī)律分析
4 討論
    4.1 C2C12成肌分化過程中差異表達(dá)miRNAs
    4.2 染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄因子對miRNAs基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
    4.3 Hippo信號通路對成肌細(xì)胞分化的調(diào)控
    4.4 MAPK/Erk信號通路對成肌細(xì)胞分化的作用
5 小結(jié)
    5.1 本研究的主要結(jié)論
    5.2 本研究的創(chuàng)新點與特色
    5.3 本研究不足之處與下一步工作建議
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文題錄
致謝



本文編號：3700360