本文關(guān)鍵詞：楊樹同源重組特點(diǎn)及2n配子雜合性分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：基于未減數(shù)配子(2n配子)雜交的有性多倍化是產(chǎn)生植物多倍體的主要途徑。同源重組則是不同類型2n配子雜合性差異的重要原因。同源重組及2n配子形成途徑共同決定了2n配子的雜合性變化,進(jìn)而影響異源多倍體的雜合性表現(xiàn)。開展植物同源重組特性以及2n配子雜合性研究,有效辨別三倍體種質(zhì)來源以及不同來源的2n配子傳遞親本雜合性差異等,對于促進(jìn)林木多倍體育種理論基礎(chǔ)研究以及2n配子有效利用具有重要意義。本研究在創(chuàng)建3個不同2n配子來源的‘哲引3號楊’(Populus pseudo-simonii × P. nigra var. italica'Zheyin-3')ב北京楊’(P.× beijingensis)全同胞異源三倍體群體以及二倍體對照群體的基礎(chǔ)上,首次提出了一種高等植物同源重組產(chǎn)物異源雙鏈DNA (heteroduplex DNA, hDNA)的檢測策略,并依據(jù)該策略對母本‘哲引3號楊’的同源重組特點(diǎn)進(jìn)行了剖析,進(jìn)而依據(jù)染色體不同位點(diǎn)的同源重組信息篩選適宜標(biāo)記位點(diǎn),開展了2n配子形成途徑鑒定以及不同形成途徑的2n配子雜合性分析等。主要研究結(jié)果如下：(1)通過大孢子染色體加倍及胚囊染色體加倍建立了一套不同2n配子形成途徑的全同胞楊樹異源三倍體群體。其中,以‘哲引3號楊’雌花芽發(fā)育狀態(tài)作為參照,在雌花芽狀態(tài)處于芽鱗張開、花序微露時,即大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂處于雙線期-終變期時施加高溫41℃連續(xù)處理4 h誘導(dǎo)大孢子染色體加倍,獲得來源于減數(shù)第一次分裂核復(fù)原(first-division restitution, FDR)和減數(shù)第二次分裂核復(fù)原(second-division restitution, SDR)的異源三倍體164株；同時,以‘哲引3號楊’雌蕊柱頭最佳授粉時期作為起始參照點(diǎn),對授粉后54-84h的‘哲引3號楊’雌花序施加高溫41℃連續(xù)處理4h誘導(dǎo)胚囊染色體加倍,獲得減數(shù)后分裂核復(fù)原(post-meiotic restitution, PMR)的異源三倍體94株。為開展2n配子來源鑒定與雜合性評價研究提供了材料基礎(chǔ)。(2)提出了一種通過抑制楊樹減數(shù)后分離(post-meiotic segreation, PMS)實(shí)現(xiàn)同源重組產(chǎn)物hDNA直接檢測的新策略,首次從DNA水平實(shí)現(xiàn)了高等植物同源重組的直接檢測。在減數(shù)分裂結(jié)束后的胚囊發(fā)育時期施加理化處理抑制染色體減數(shù)后分離,從而使攜帶同源重組產(chǎn)物hDNA的兩條姐妹染色單體在胚囊發(fā)育的有絲分裂過程中不分離而共存于同一2n配子中；利用這種2n配子與異性正常配子交配,可以獲得異源三倍體后代；最終采用共顯性簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR)分子標(biāo)記對此來源的異源三倍體進(jìn)行分析,從而確定同源重組產(chǎn)物hDNA產(chǎn)生與否。首次證明了楊樹同源重組過程中的確有hDNA產(chǎn)生,實(shí)現(xiàn)了從DNA水平直接檢測被子植物同源重組產(chǎn)物hDNA。該策略具有成本低廉、不需要高端復(fù)雜的技術(shù)手段以及適用于未測序物種等優(yōu)點(diǎn),為楊樹等被子植物的同源重組機(jī)制研究開辟了一條新的研究途徑。(3)基于提出的高等植物同源重組產(chǎn)物hDNA檢測策略,首次揭示了楊樹同源重組特性。研究結(jié)果表明,染色體上不同SSR標(biāo)記位點(diǎn)處的hDNA頻率不同,介于5.3%至76.6%之間；hDNA頻率與檢測位點(diǎn)距著絲粒間的距離存在顯著性相關(guān),與檢測位點(diǎn)周圍的重組率、甲基化程度、長末端重復(fù)(long terminal repeat, LTR)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子以及低復(fù)雜性序列重復(fù)比率、轉(zhuǎn)錄本豐度等遺傳因素間存在共變異,且與染色體物理長度間無關(guān)；發(fā)現(xiàn)‘哲引3號楊’大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中有89.89%的染色體經(jīng)歷了1-3次重組事件,但與以往相關(guān)研究結(jié)果不同的是,有5.57%染色體經(jīng)歷了4-5次重組事件,有1條6號染色體經(jīng)歷了6次重組事件,如此高的同源重組次數(shù)可能與母本‘哲引3號楊’的高度雜合性有關(guān)。(4)提出了一種利用低重組率區(qū)域的SSR分子標(biāo)記位點(diǎn)鑒定植物2n配子形成途徑的分子檢測策略,實(shí)現(xiàn)了FDR、SDR型2n配子的準(zhǔn)確鑒別。針對大孢子發(fā)生存在不同步性導(dǎo)致FDR、SDR型2n配子來源的楊樹異源三倍體難以辨別,以及同源重組影響2n配子形成途徑判別準(zhǔn)確性等問題,基于楊樹同源重組特點(diǎn)分析,提出選取位于低重組率區(qū)域的SSR分子標(biāo)記位點(diǎn)精確鑒定異源三倍體的2n配子發(fā)生途徑的策略；進(jìn)而采用篩選出的6個低重組率SSR分子標(biāo)記對164株大孢子染色體加倍途徑來源的異源三倍體進(jìn)行分析,證明其中40株源自FDR型2n配子,124株源自SDR型2n配子。2n配子來源途徑的準(zhǔn)確判別為下一步開展不同類型2n配子雜合性評價及有效利用奠定了基礎(chǔ)。(5)從群體水平分析了不同來源的青楊2n配子傳遞親本雜合性特點(diǎn),基于同源重組特點(diǎn)提出楊樹雜合性分析的SSR分子標(biāo)記引物綜合選擇策略。不同來源的2n配子雜合性分析結(jié)果顯示,不同染色體傳遞親本雜合度不同,其中經(jīng)FDR型2n配子的不同染色體傳遞親本雜合度的變異系數(shù)最低,為13.50%；而SDR及PMR型2n配子的相應(yīng)變異系數(shù)分別為51.92%及63.14%,其原因在于FDR型2n配子只有1/2染色體受到同源重組影響的緣故；證明SDR及PMR型2n配子分別傳遞親本的平均雜合度為39.58%及35.90%,而FDR型2n配子傳遞親本的雜合度達(dá)到74.80%,顯著高于SDR及PMR型2n配子。此外,基于同源重組特點(diǎn)分析,提出了一種適宜引物選擇為主、引物隨機(jī)選擇為輔的引物綜合選擇策略,為今后雜合性分析中多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)的有效選擇提供了依據(jù)。有關(guān)研究對于楊樹以及其他物種植物2n配子的理論研究與高效利用具有重要意義。(6)針對一般認(rèn)為傳遞親本雜合性高的FDR型2n配子在育種中有較高的利用價值的觀點(diǎn)提出不同的認(rèn)識。從楊樹同源重組的特點(diǎn)看,盡管SDR型、PMR型2n配子傳遞親本的平均雜合度約為FDR型2n配子的一半,由于楊樹hDNA頻率與檢測位點(diǎn)周圍的轉(zhuǎn)錄本豐度間存在正相關(guān)關(guān)系,表明染色體交換產(chǎn)生的雜合位點(diǎn)多位于染色體基因密集區(qū)域,SDR型、PMR型2n配子在該染色體區(qū)域的決定具體目標(biāo)性狀的基因必然因同源重組而處于雜合狀態(tài),其在此區(qū)域傳遞的親本雜合性可能反而更高,表明SDR及PMR型2n配子在育種中的利用價值不一定比FDR型2n配子低,三種類型的2n配子都應(yīng)具有一定的利用價值。
【關(guān)鍵詞】：楊樹 異源三倍體 同源重組 hDNA 2n配子來源 FDR SDR PMR 鑒定 雜合性 策略
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S792.11
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-12
• 縮略詞表12-13
• 目錄13-16
• 引言16-18
• 1 文獻(xiàn)綜述18-34
• 1.1 植物同源重組研究進(jìn)展18-23
• 1.1.1 基因連鎖及同源重組的發(fā)現(xiàn)18-19
• 1.1.2 同源重組發(fā)生機(jī)制及其模型19-21
• 1.1.3 同源重組檢測技術(shù)及其特點(diǎn)研究21-23
• 1.2 植物2n配子發(fā)生途徑及其雜合性研究進(jìn)展23-26
• 1.2.1 植物2n配子發(fā)生途徑及其鑒定24-25
• 1.2.2 植物2n配子傳遞的雜合性研究25-26
• 1.3 問題與對策26-34
• 1.3.1 創(chuàng)新同源重組檢測技術(shù)是準(zhǔn)確鑒定植物2n配子的關(guān)鍵26-33
• 1.3.2 從群體水平入手是科學(xué)、準(zhǔn)確評價2n配子的前提33-34
• 2 楊樹2n雌配子誘導(dǎo)與異源三倍體群體的建立34-42
• 2.1 材料與方法34-36
• 2.1.1 研究材料及其來源34-35
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法35-36
• 2.1.2.1 大孢子染色體加倍35-36
• 2.1.2.2 胚囊染色體加倍36
• 2.1.2.3 子代植株倍性水平檢測36
• 2.2 結(jié)果與分析36-39
• 2.2.1 大孢子染色體加倍誘導(dǎo)青楊異源三倍體37-38
• 2.2.2 胚囊染色體加倍誘導(dǎo)青楊異源三倍體38-39
• 2.3 小結(jié)39-42
• 3 楊樹同源重組檢測方法及其特點(diǎn)研究42-60
• 3.1 材料與方法42-45
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料42-43
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法43-45
• 3.1.2.1 基因組DNA的提取43
• 3.1.2.2 基因組DNA質(zhì)量的檢測43-44
• 3.1.2.3 熒光標(biāo)記的TP-M13-SSR PCR44
• 3.1.2.4 多態(tài)性引物的篩選44-45
• 3.1.2.5 統(tǒng)計分析45
• 3.2 結(jié)果與分析45-58
• 3.2.1 高等植物同源重組檢測方法的提出45-48
• 3.2.2 高等植物同源重組檢測方法的驗(yàn)證48-53
• 3.2.3 楊樹同源重組特點(diǎn)研究53-58
• 3.2.3.1 楊樹hDNA發(fā)生頻率及其特點(diǎn)53-57
• 3.2.3.2 楊樹同源重組事件發(fā)生的次數(shù)57-58
• 3.3 小結(jié)58-60
• 4 楊樹2n配子發(fā)生途徑的分子標(biāo)記鑒定60-70
• 4.1 材料與方法60-61
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料60-61
• 4.1.2 DNA提取及TP-M13-SSR PCR61
• 4.2 結(jié)果與分析61-68
• 4.2.1 適于2n配子形成途徑鑒定的SSR引物篩選61-63
• 4.2.2 大孢子染色體加倍來源的楊樹三倍體形成途徑鑒定63-66
• 4.2.3 引物的選擇對三倍體形成途徑分析的影響66-68
• 4.3 小結(jié)68-70
• 5 楊樹不同來源2n配子雜合性分析70-88
• 5.1 材料與方法70-71
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料70
• 5.1.2 實(shí)驗(yàn)方法70-71
• 5.1.2.1 DNA提取及TP-M13-SSR PCR71
• 5.1.2.2 楊樹不同來源2n配子的雜合性分析71
• 5.1.2.3 統(tǒng)計分析71
• 5.2 結(jié)果與分析71-85
• 5.2.1 楊樹不同來源2n配子的雜合性分析71-78
• 5.2.1.1 用于2n配子雜合性分析的多態(tài)性SSR引物的篩選71-76
• 5.2.1.2 楊樹不同來源的2n配子的雜合性分析76-78
• 5.2.2 多態(tài)性SSR引物選擇策略分析78-84
• 5.2.2.1 引物有序選擇策略78-80
• 5.2.2.2 引物隨機(jī)選擇策略80-82
• 5.2.2.3 適宜引物選擇策略82-84
• 5.2.3 SSR引物評價與引物綜合選擇策略84-85
• 5.3 小結(jié)85-88
• 6 討論88-96
• 6.1 有關(guān)高等植物hDNA的檢測方法88-89
• 6.2 楊樹hDNA發(fā)生及同源重組特點(diǎn)89-91
• 6.3 楊樹2n配子來源鑒定及其傳遞親本雜合性分析91-93
• 6.4 楊樹多倍體育種策略93-96
• 7 結(jié)論96-98
• 參考文獻(xiàn)98-108
• 個人簡介108-110
• 成果清單110-112
• 導(dǎo)師簡介112-114
• 致謝114-11

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本文編號：369240