乳腺是哺乳動物特有的可泌乳的分泌型器官,乳腺上皮細胞是體外研究乳腺生理功能的重要模型,是體內(nèi)泌乳系統(tǒng)細胞的典型代表。泌乳性狀作為奶山羊重要的性狀之一,研究乳汁主要成分乳蛋白和乳脂形成的分子機制可為奶山羊分子育種提供理論依據(jù),加快育種進程。MiRNA是一類多靶點的非編碼RNA,通過種子位點與靶基因結合,對靶基因進行轉錄后調(diào)控,繼而參與多種生物進程。MiRNA在不同泌乳時期的差異表達顯示miRNA在調(diào)節(jié)泌乳性狀方面發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究顯示奶山羊乳腺中novel-miR-3880在奶山羊泌乳高峰期的表達量較高,有報道指出泌乳高峰期乳腺中代謝速率明顯加快,底物攝取增加,蛋白和脂質(zhì)合成增多,由此推測novel-miR-3880在乳腺發(fā)育和乳合成中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。環(huán)狀RNA是一類可變剪切產(chǎn)生的共價閉環(huán)非編碼RNA,有多個miRNA結合位點,可作為miRNA分子海綿與miRNA靶基因產(chǎn)生競爭性結合,從而減弱miRNA對靶基因的調(diào)節(jié)作用。然而,novel-miR-3880和環(huán)狀RNA在奶山羊泌乳分子機制方面研究較少。本課題組前期通過高通量測序建立了奶山羊環(huán)狀RNA數(shù)據(jù)庫,通過生物信息學分析,預... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【部分圖文】：

乳腺泌乳過程

織差異表達檢測。2.2.2.2小鼠活體試驗及樣品采集選取年齡、體重、胎次、仔鼠數(shù)和仔鼠重相近的同一天產(chǎn)仔的小鼠18只，分為3組，每組6只，飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，提供自由飲食和自由飲水，正常哺乳，產(chǎn)后第3天開始注射處理以免引起應激過大導致小鼠死亡，試驗過程每窩小鼠分籠飼養(yǎng)，保證其生存環(huán)境，并每天更換墊料、水和食物。合成的novel-miR-3880agomir和ELF2siRNA（siELF2）用生理鹽水稀釋，對照組注射等量的生理鹽水，試驗組以10nmol/次/只的劑量注射，間隔3天或4天注射一次，第22天收集母鼠乳腺組織和血樣，試驗過程概要如圖2-1所示。圖2-1小鼠處理示意圖Figure2-1Schematicdiagramofmicetreatment2.2.3細胞培養(yǎng)參照Wang等(Wang,Luoetal.2010)的方法分離純化奶山羊乳腺上皮細胞并采用免疫熒光技術進行鑒定。純化好的細胞在細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)液配方為DMEM/F12基礎培養(yǎng)基，10%的胎牛血清和雙抗。細胞傳代時棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗細胞三次后加入胰蛋白酶細胞消化液，待細胞變圓時用細胞培養(yǎng)液終止消化，并輕輕吹打成均勻的細胞懸液，一分為二，繼續(xù)置于37℃CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)保持濕潤環(huán)境。2.2.4細胞小RNA轉染本研究所有的小RNA序列見附錄三。按照LipofectamineRNAiMAXReagent（Invitrogen）轉染試劑說明書轉染細胞，轉染試劑的體積為小RNA體積的三倍，分別加入無血清培養(yǎng)基中配置好后將小RNA溶液加入轉染試劑溶液中，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘，加入細胞中搖勻即可。2.2.5轉錄組生物信息學分析2.2.5.1RNA提取按照Trizol試劑說明書提取RNA，具體步驟見附錄四，提取的RNA用于轉錄組測序或RT-qPCR，轉錄組測序中RNA質(zhì)量用Agilentbioanalyzer2100芯片生物分析

第二章山羊novel-miR-3880下游差異基因的篩選及其對乳腺發(fā)育的調(diào)控作用23圖2-2Novel-miR-3880差異基因篩選及驗證Figure2-2Screeninganddetectionofdifferentiallyexpressedgenes（DEGs）ofnovel-miR-3880（a）Novel-miR-3880差異基因在火山圖中的顯示；（b）Novel-miR-3880差異基因數(shù)量；（c）測序結果中10個差異基因?qū)崟r定量PCR驗證（a）Novel-miR-3880DEGsinvolcanoplot；（b）Numberofnovel-miR-3880DEGs；（c）RT-qPCRdetectionof10DEGs2.3.2Novel-miR-3880下游差異基因GO富集分析對獲得的67個差異基因進行GO注釋，并以參與的生物過程、基因的分子功能和細胞組分進行基因功能分類，富集結果顯示novel-miR-3880參與23個細胞代謝途徑，包括8個生物進程相關代謝途徑、5個分子功能相關代謝途徑和10個細胞組分相關代謝途徑（圖2-3）。其中富集下游差異基因最多的代謝進程集中在生物進程，包括免疫系統(tǒng)進程（GO:0002376）、應激反應（GO:0050896）、細胞進程（GO:0009987）和單有機體代謝進程（GO:0008152）等。


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