胸膜肺炎放線桿菌GalT蛋白免疫保護與促炎功能研究
發(fā)布時間：2021-09-06 00:32
胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）是豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia,PCP）的致病菌,該病原能引起豬的纖維素性胸膜炎和出血性肺炎,給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經濟損失。研究證明胸膜肺炎放線桿菌具有多種毒力因子,包括Apx分泌外毒素、脂多糖、莢膜多糖等。這些毒力因子都是體外培養(yǎng)條件下表達的,對APP體內誘導抗原的研究并不多。體內誘導抗原是病原菌在感染過程中特異表達的抗原,這些抗原在致病過程中發(fā)揮著重要作用。鑒定胸膜肺炎防線桿菌體內誘導表達抗原,有利于進一步揭示其感染的機制。本研究運用體內誘導抗原技術篩選到APP的體內誘導抗原,證明這些抗原在感染過程中優(yōu)先表達。免疫學實驗證明APP體內誘導抗原半乳糖代謝相關酶（GalT）能誘導有效的體液免疫和細胞免疫應答,是良好的免疫原。研究證明GalT刺激巨噬細胞能促進促炎性細胞因子的分泌,同時揭示了此過程中的信號轉導通路。具體工作如下:1、APP體內誘導抗原GalT的鑒定及轉錄分析本研究使用運用體內誘導抗原技術（IVIAT）鑒定了APP感染過程中體...
【文章來源】：四川農業(yè)大學四川省 211工程院校
【文章頁數】：126 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
運用qRT-PCR分析體內誘導抗原體內外表達水平差異
圖 2.1 利用生物信息學方法預測活體誘導抗原的抗原特性Fig 2.1Antigenic properties of the in vivo-induced antigens predicted using a bioinformatics approach.1.6 體內誘導抗原重組表達菌株的構建從 NCBI 數據庫中檢索體內誘導抗原基因并保存。使用 Primer Premier 5 軟件設計克隆這些基因序列的引物。這些體內誘導抗原基因序列的引物的具體內容，包括序列和產物等內容見表 2.1。在這些引物序列中，帶有下劃線的核苷酸序列代表添加的限制性酶切位點。于 TSB 中 37℃過夜培養(yǎng) APP L20 菌株，使用基因組提取試劑盒抽提 APP 基因組 DNA。以抽提的基因組 DNA 為模板，用 PCR 方法擴增六個體內誘導抗原的基因。使用相應的限制性內切酶對擴增序列和 pET-28a 進行酶切。用 T4 DNA連接酶連接擴增序列片段和暴露酶切位點的 pET-28a，將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α。用 PCR 擴增和限制性酶切分析方法證明重組子，并對插入序列進行測序分析。用 BLAST 對測序結果進行進一步比對分析。
2 結果2.1 重組蛋白的表達與免疫印跡分析PCR 擴增表達重組蛋白菌株的基因序列，測序和用限制性酶切分析。PCR、測限制性酶切分析證明，PCR 擴增片段和酶切結果獲得了預期大小片段，測序結明該片段序列與 L20 菌株基因組序列一致。將重組質粒成功轉化進大腸桿菌 BL達菌株，并成功表達了組氨酸標簽融合蛋白。SDS-PAGE 電泳結果表明大腸桿菌達出來預期大小的融合蛋白。用鎳離子親和層析方法純化重組融合蛋白，DS-PAGE 電泳分析純化結果(圖 2.2A)。運用重組蛋白抗血清進行免疫印跡分析。個體內誘導抗原的 SDS-PAGE 電泳結果對比(圖 2.2A)，在免疫印跡結果上相應大置均有相應的反應條帶(圖 2.2B)。結果表明，這些蛋白均能與相應的抗血清反應這些蛋白具有抗原性能夠誘導動物產生 IgG。A. B.
【參考文獻】：
期刊論文
[1]豬胸膜肺炎放線桿菌菌影的制備與免疫試驗[J]. 杜崇濤,李林溪,雷連成,張守勤,韓文瑜,王文東. 中國獸醫(yī)學報. 2012(10)
[2]表達ApxIA的血清7型胸膜肺炎放線桿菌弱毒菌株的構建及特性分析[J]. 劉金林,陳硯,胡琳琳,貝為成,陳煥春. 生物工程學報. 2010(03)
[3]增強豬傳染性胸膜肺炎滅活苗對小鼠保護力的研究[J]. 王勇,劉思國,王春來,邵美麗,劉建東,宮強,遲磊,趙昆,郭設平,車廣頭. 中國預防獸醫(yī)學報. 2007(06)
[4]豬胸膜肺炎調查及地方適用型滅活疫苗的研制[J]. 葉潤全,冼瓊珍,麥志均,陳理,顧萬軍. 畜牧與獸醫(yī). 2007(01)
[5]豬胸膜肺炎放線桿菌脂多糖的制備及對小鼠的免疫保護作用[J]. 劉霞,刁有祥,禚寶山,于申業(yè),鞠洪濤. 中國預防獸醫(yī)學報. 2006(05)
[6]重組ApxⅡA對胸膜肺炎放線桿菌滅活疫苗免疫效果的影響[J]. 王春來,劉思國,邵美麗,王勇,宮強,郭設平,劉建東,趙昆,遲磊. 中國獸醫(yī)科學. 2006(06)
[7]新型基因工程亞單位菌苗對豬傳染性胸膜肺炎的保護效力研究[J]. 劉建杰,陳煥春,李沖,何啟蓋,吳斌. 中國農業(yè)科學. 2005(03)
碩士論文
[1]豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及其核酸疫苗的初步研究[D]. 彭娟.四川農業(yè)大學 2011
本文編號：3386374
【文章來源】：四川農業(yè)大學四川省 211工程院校
【文章頁數】：126 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
運用qRT-PCR分析體內誘導抗原體內外表達水平差異
圖 2.1 利用生物信息學方法預測活體誘導抗原的抗原特性Fig 2.1Antigenic properties of the in vivo-induced antigens predicted using a bioinformatics approach.1.6 體內誘導抗原重組表達菌株的構建從 NCBI 數據庫中檢索體內誘導抗原基因并保存。使用 Primer Premier 5 軟件設計克隆這些基因序列的引物。這些體內誘導抗原基因序列的引物的具體內容，包括序列和產物等內容見表 2.1。在這些引物序列中，帶有下劃線的核苷酸序列代表添加的限制性酶切位點。于 TSB 中 37℃過夜培養(yǎng) APP L20 菌株，使用基因組提取試劑盒抽提 APP 基因組 DNA。以抽提的基因組 DNA 為模板，用 PCR 方法擴增六個體內誘導抗原的基因。使用相應的限制性內切酶對擴增序列和 pET-28a 進行酶切。用 T4 DNA連接酶連接擴增序列片段和暴露酶切位點的 pET-28a，將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α。用 PCR 擴增和限制性酶切分析方法證明重組子，并對插入序列進行測序分析。用 BLAST 對測序結果進行進一步比對分析。
2 結果2.1 重組蛋白的表達與免疫印跡分析PCR 擴增表達重組蛋白菌株的基因序列，測序和用限制性酶切分析。PCR、測限制性酶切分析證明，PCR 擴增片段和酶切結果獲得了預期大小片段，測序結明該片段序列與 L20 菌株基因組序列一致。將重組質粒成功轉化進大腸桿菌 BL達菌株，并成功表達了組氨酸標簽融合蛋白。SDS-PAGE 電泳結果表明大腸桿菌達出來預期大小的融合蛋白。用鎳離子親和層析方法純化重組融合蛋白，DS-PAGE 電泳分析純化結果(圖 2.2A)。運用重組蛋白抗血清進行免疫印跡分析。個體內誘導抗原的 SDS-PAGE 電泳結果對比(圖 2.2A)，在免疫印跡結果上相應大置均有相應的反應條帶(圖 2.2B)。結果表明，這些蛋白均能與相應的抗血清反應這些蛋白具有抗原性能夠誘導動物產生 IgG。A. B.
【參考文獻】：
期刊論文
[1]豬胸膜肺炎放線桿菌菌影的制備與免疫試驗[J]. 杜崇濤,李林溪,雷連成,張守勤,韓文瑜,王文東. 中國獸醫(yī)學報. 2012(10)
[2]表達ApxIA的血清7型胸膜肺炎放線桿菌弱毒菌株的構建及特性分析[J]. 劉金林,陳硯,胡琳琳,貝為成,陳煥春. 生物工程學報. 2010(03)
[3]增強豬傳染性胸膜肺炎滅活苗對小鼠保護力的研究[J]. 王勇,劉思國,王春來,邵美麗,劉建東,宮強,遲磊,趙昆,郭設平,車廣頭. 中國預防獸醫(yī)學報. 2007(06)
[4]豬胸膜肺炎調查及地方適用型滅活疫苗的研制[J]. 葉潤全,冼瓊珍,麥志均,陳理,顧萬軍. 畜牧與獸醫(yī). 2007(01)
[5]豬胸膜肺炎放線桿菌脂多糖的制備及對小鼠的免疫保護作用[J]. 劉霞,刁有祥,禚寶山,于申業(yè),鞠洪濤. 中國預防獸醫(yī)學報. 2006(05)
[6]重組ApxⅡA對胸膜肺炎放線桿菌滅活疫苗免疫效果的影響[J]. 王春來,劉思國,邵美麗,王勇,宮強,郭設平,劉建東,趙昆,遲磊. 中國獸醫(yī)科學. 2006(06)
[7]新型基因工程亞單位菌苗對豬傳染性胸膜肺炎的保護效力研究[J]. 劉建杰,陳煥春,李沖,何啟蓋,吳斌. 中國農業(yè)科學. 2005(03)
碩士論文
[1]豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及其核酸疫苗的初步研究[D]. 彭娟.四川農業(yè)大學 2011
本文編號：3386374
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