白細胞介素-17（Interleukin-17,IL-17）是Th17細胞的特征性細胞因子,被認為是一種關(guān)鍵的促炎性細胞因子,在宿主抵抗胞外菌、真菌感染,以及炎癥、超敏反應(yīng)、自身免疫病等多種疾病過程中均起到了重要的作用。山羊的很多炎癥性疾病如乳腺炎是損害山羊健康,制約養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展的重要因素。但IL-17與山羊乳腺炎等炎癥性疾病之間關(guān)系的基礎(chǔ)研究還比較少,缺乏有效的山羊IL-17單克隆抗體是阻礙IL-17相關(guān)山羊疾病機理深入研究的一個重要原因。本研究根據(jù)Gen Bank公布的奶山羊IL-17A CDS區(qū)序列（不含信號肽序列）設(shè)計原核表達引物,從Con A活化的奶山羊外周血單個核細胞中提取細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄PCR法擴增目的基因,連接到原核表達載體p ET 32a后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Tans B（DE3）感受態(tài)細胞進行原核表達,并對原核表達條件進行了優(yōu)化,實現(xiàn)目的蛋白的可溶性表達,并對純化條件進行了優(yōu)化。隨后,本研究以純化的原核表達重組山羊IL-17A（r IL-17A）免疫BABL/c小鼠,使用免疫小鼠的脾細胞與SP2/0細胞融合,最終篩選出能分泌抗羊IL-17A單克隆抗體的融合雜... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：98 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

IL-17受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路圖（引自(Gaffen2009)）

文獻綜述3要的作用(Changetal.2006)。Act1也可以激活有絲分裂原活化的蛋白激酶家族(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)，該家族能夠進一步活化激活蛋白-1(activatorprotein-1，AP-1)(Changetal.2006)。圖1-1IL-17及受體家族（引自(Gaffen2009)）Figure1-1IL-17ligandandreceptorfamilymembers圖1-2IL-17受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路圖（引自(Gaffen2009)）Figure1-2IL-17receptorsignaltransduction

第二章山羊IL-17A基因的克隆與原核表達21槽，加入預(yù)冷的膜轉(zhuǎn)移Buffer和冰盒，并且在槽外用冰塊覆蓋降溫，90V濕轉(zhuǎn)85min；（3）封閉：放入含5%脫脂乳的PBST中室溫封閉2h，PBST洗膜3次，（4）孵育一抗：放入PBST稀釋的一抗（MouseAnti-Histagantibody，含1%脫脂，1:5000稀釋），4℃平緩搖動孵育過夜；（5）孵育二抗：用PBST漂洗膜3次，放入PBST稀釋的二抗（GoatAnti-MouseIgG/HRPantibody，含1%脫脂，1:5000稀釋），室溫緩慢搖動孵育1h；（6）顯色：取出膜，用PBST漂洗膜3次，加入ECL溶液進行顯色。2.3結(jié)果與分析2.3.1山羊IL-17A無信號肽CDS區(qū)PCR擴增結(jié)果PBMCs經(jīng)ConA刺激后提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄擴增IL-17A基因編碼區(qū)（不含信號肽部分），在400bp位置左右出現(xiàn)擴增片段，與目的片段預(yù)期大小（393bp）相符（圖2-1）。圖2-1山羊IL-17ACDS區(qū)擴增結(jié)果Figure2-1CloningoftheCDSregionofgoatIL-17AM,DNAMarkerDL500;N,陰性對照;1,山羊IL-17APCR擴增產(chǎn)物。M,DNAMarkerDL500;N,negativecontrol;Lane1,PCRproductsofgoatIL-17A.2.3.2重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定結(jié)果目的基因片段與pET32a原核表達載體連接后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TransB(DE3)，經(jīng)過菌液PCR鑒定，擴增出與目的基因大小相符的片段（圖2-2）。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]奶山羊?qū)嶒炐匀榉垦椎牟±斫M織學(xué)觀察及促炎性細胞因子的檢測[J]. 韓炎森,牟珊,陳德坤.  動物醫(yī)學(xué)進展. 2011(08)
[2]奶山羊乳腺上皮細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定[J]. 王楨,羅軍,王偉,趙旺生,林先滋.  生物工程學(xué)報. 2010(08)
[3]A novel heterodimeric cytokine consisting of IL-17 and IL-17F regulates inflammatory responses[J]. Seon Hee Chang.  Cell Research. 2007(05)

博士論文
[1]奶山羊隱性乳腺炎的流行病學(xué)調(diào)查及S.aureus感染小鼠乳腺后Th細胞免疫應(yīng)答機制研究[D]. 趙燕清.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2015

碩士論文
[1]山羊IL-17單克隆抗體的制備與鑒定[D]. 桑鋒鋒.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2017
[2]我國奶山羊主要養(yǎng)殖省份隱性乳房炎的調(diào)查及病原菌多重PCR檢測方法的建立[D]. 姚運亮.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2013
[3]奶山羊Th17細胞主要效應(yīng)分子的克隆表達[D]. 趙莉娟.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2011
[4]奶山羊乳腺上皮細胞系的建立及脂肪酸合酶基因的RNA干擾研究[D]. 王偉.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2009



本文編號：3295696