CUP-SHAPED COTYLEDON 2（CUC2）基因是植物NAC（NAM/ATAF/CUC）家族轉錄因子之一,其在頂端分生組織的形成、器官生長位置及邊界的確立、腋生分生組織形成和葉形變異等過程中發(fā)揮重要作用。目前,該基因的功能挖掘大多集中在模式植物中,而在木本植物中的研究鮮見報道。本研究團隊前期在對兩種不同葉形和株型的樺樹,裂葉樺（Betula pendula’Dalecarlica’）和歐洲白樺Betula pendula),葉片轉錄組分析時發(fā)現(xiàn)眾多關鍵基因,其中BpCUC2基因在裂葉樺中顯著上調表達。為了揭示BpCUC2的分子功能,本研究對該基因進行了組織表達特性、生物信息學分析,對獲得的轉基因株系進行表型特性分析和解剖學觀察,并采用轉錄組測序、酵母單雜交（Yeast one-hybrid）和 ChIP-PCR（Chromatin Immunoprecipitation-PCR）等技術篩選和驗證其上游及下游調控基因。另外,對該基因的上游調控基因BpmiR164（BpmicroRNA164）進行了組織表達特性和生物信息學分析,并進行遺傳轉化。研究結果如下:（1）生物信息學和組... 

【文章來源】：東北林業(yè)大學黑龍江省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１－５技術路線??Ｆｉｇｕｒｅ?１－５?Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ?ｒｏｕｔｅ??

?２?ＢｐＣＵＣ２基因功能研究???２．３．２?ＢｐＣＵＣ２轉錄因子亞細胞定位??暗培養(yǎng)一天后的洋蔥表皮于激光共聚焦下觀察，結果顯示：用陽性質粒??ＰＣＡＭＢＩＡ１３００轟擊的洋蔥表皮細胞中細胞膜和細胞核中均能觀察到ＧＦＰ綠色熒光，而??用３５Ｓ：：ＢｐＣＵＣ２質粒轟擊的洋蔥表皮細胞中，ＧＦＰ綠色熒光只在細胞核中能被觀察??到，說明ＢｐＣＵＣ２轉錄因子定位在細胞核中。??圖２－４?ＢｐＣＵＣ２轉錄因子的亞細胞定位??Ｆｉｇｕｒｅ?２－４?Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ?ｌｏｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＢｐＣＵＣ２??２．３．３?ＢｐＣＵＣ２轉錄激活域研究??２．３．３．１?ｐＧＢＫＴ７－ＢｐＣＵＣ２?載建??以?ｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ＢｐＣＵＣ２?質粒為模板，以?ＢＤ－ＣＵＣ２－Ｆ?和?ＢＤ－ＣＵＣ２－Ｒ?為引物進??行ＰＣＲ，電泳結果如圖２－５所示，結果顯示擴增序列長度與目的片段長度一致。??＿??Ｍ，?ＤＮＡＭａｒｋｅｒ，ＤＬ２０００；泳道?１，水對照；泳道?２，ＢｐＣＵＣ２ＰＣＲ?產(chǎn)物??Ｍ，?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ，?ＤＬ２０００；?Ｌａｎｅ?１，?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?（ｔｅｍｐｌａｔｅ?ｉｓ?ｄｄＨ２〇）；?Ｌａｎｅ?２，?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ??ＢｐＣＵＣ２??圖２－５?ＰＣＲ擴增辦ＣＵＣ２序列??Ｆｉｇｕｒｅ?２－５?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＢｐＣＵＣ２?ｇｅｎｅ??將辦ＣｉＴＣ２序列進行ＰＣＲ產(chǎn)物膠回收，與酶切后的ｐＧＢＫＴ７載體進行同源重組連??接，連接后的質粒轉入ＤＨ５ａ大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取在卡那霉素抗性平板上生長的??菌落進行菌液ＰＣＲ，上游引物使用ＢＤ

７空載體（陰性對照）轉入大腸桿菌ＤＨ５ａ大腸桿菌感受態(tài)細??胞，挑取在卡那霉素抗性平板上生長的菌落進行菌液ＰＣＲ，上游引物采用ＢＤ－ＣＵＣ２－??Ｆ，下游引物使用通用引物Ｔ７－Ｒ，將ＰＣＲ條帶位置正確的菌液送測序，將測序正確菌??液提取質粒，置于－２０°Ｃ保存?zhèn)溆谩??分別將構建好的辦不同區(qū)段與ｐＧＢＫＴ７載體連接的質粒轉入Ｙ２Ｈ酵母感受??態(tài)細胞中，將轉化后的酵母感受態(tài)細胞涂布于ＳＤ／－Ｔｒｐ和ＳＤ／－Ｔｒｐ／Ｘ－ａ－Ｇａ丨培養(yǎng)基上，通??過顯色情況判斷其是否具有自激活作用，結果如圖２－８所示：??ＳＤＭＴ?迎＇－—■＊＂＊??己－Ｊ?□?Ｑ??Ｉ?８Ｄ?：：遍?ＮＡＣ?ｄｏｍａｉｎ??１０６５?□?□??；ｎｊｐ?ＢＤｌ?Ｆ／Ｒ?４２６?□?□??ｆ?ＢＤ?Ｉ?１?｜?１０６５?〇?□??「—『：兩—?????—｜?ＢＤ３?Ｆ／Ｒ?｜?９０６?□?□??｜??ＢＤ４?Ｆ／Ｒ?７４７??Ｅｐ５?Ｆ／Ｒ?Ｌ＇二二??Ｕ?．．：，ｇ碟１３?二］５８８?Ｄ?Ｄ??圖２－８辦Ｃｆ／Ｃ２轉錄因子不同區(qū)段自激活檢測及結構示意圖??Ｆｉｇｕｒｅ?２－８?Ｔｈｅ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ?ｒｅｇｉｏｎ?ｏｆ?ＢｐＣＵＣ２??從圖中可以看出，辦ＣＣ／Ｃ２基因的５個區(qū)域片段中具有轉錄自激活活性的區(qū)域為氨??基酸的Ｃ端，因此ＢＰＣＵＣ２轉錄因子的轉錄自激活區(qū)域位于該基因的Ｃ端。隨著進一??步縮短Ｃ端的片段，結果發(fā)現(xiàn)，轉化ｐＧＢＫＴ７－氨基酸片段ＢＤ３?（４２７－９０６?ｂｐ）的酵母可??以在ＳＤ／－Ｔｒｐ培養(yǎng)基上生長且在ＳＤ／－Ｔｒｐ／Ｘ－ａ－Ｇａｌ培養(yǎng)基上變藍，但當ＢＤ３截短為ＢＤ

【參考文獻】：
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本文編號：3226904