發(fā)布時(shí)間：2017-04-17 08:05

  本文關(guān)鍵詞：家蠶幼蟲(chóng)絲腺細(xì)胞核內(nèi)有絲分裂的調(diào)控因素及相關(guān)蛋白的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：家蠶是鱗翅目昆蟲(chóng)的重要模式生物之一,同時(shí)也是重要的泌絲經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)。絲腺是家蠶幼蟲(chóng)特有的泌絲器官。家蠶絲腺細(xì)胞只在胚胎期發(fā)生約10次有絲分裂,繼而形成形態(tài)學(xué)上和功能學(xué)上可劃分的前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺,共形成約1080個(gè)細(xì)胞。自此直到幼蟲(chóng)期結(jié)束,絲腺細(xì)胞不再發(fā)生有絲分裂,只進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞體積增大的特殊核內(nèi)有絲分裂。在幼蟲(chóng)期,絲腺細(xì)胞內(nèi)基因組含量增加約40萬(wàn)倍,到五齡時(shí)絲腺細(xì)胞核幾乎布滿了整個(gè)胞質(zhì)區(qū)域,使得細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)充分接觸,大大增加了核質(zhì)間的物質(zhì)交流,為家蠶在吐絲期快速而又大規(guī)模的合成絲蛋白提供了極為有利的條件。隨著家蠶全基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的完成,許多研究學(xué)者再次把目光聚焦到家蠶絲蛋白合成的機(jī)制上。家蠶絲蛋白合成的前提是其絲腺細(xì)胞高效的核內(nèi)有絲分裂,然而絲腺細(xì)胞高效核內(nèi)有絲分裂的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。家蠶絲腺細(xì)胞發(fā)生核內(nèi)有絲分裂的時(shí)間跨度和DNA復(fù)制效率在自然界已知的生物中是最特異和高效的,闡明絲腺細(xì)胞高效核內(nèi)有絲分裂的調(diào)控機(jī)制,可為提高家蠶絲產(chǎn)量和蠶業(yè)發(fā)展提供重要理論依據(jù),也可望為完善細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制提供重要線索。本研究首先對(duì)家蠶幼蟲(chóng)期絲腺細(xì)胞核內(nèi)DNA復(fù)制變化的趨勢(shì)進(jìn)行了詳細(xì)分析；然后鑒定了蛻皮激素、保幼激素、營(yíng)養(yǎng)、胰島素對(duì)絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制的影響,進(jìn)一步闡明了影響絲腺細(xì)胞核內(nèi)有絲分裂的生理因素,并探究其調(diào)控機(jī)制,為解析家蠶幼蟲(chóng)絲腺細(xì)胞核內(nèi)有絲分裂的調(diào)控機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下：1.家蠶幼蟲(chóng)期絲腺細(xì)胞核內(nèi)DNA復(fù)制情況通過(guò)BrdU標(biāo)記方法結(jié)合組織免疫熒光技術(shù),對(duì)家蠶幼蟲(chóng)期絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制情況進(jìn)行詳細(xì)分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),家蠶幼蟲(chóng)期絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制呈波動(dòng)趨勢(shì),在剛蛻皮即眠起時(shí)有自激發(fā)現(xiàn)象,自此到盛食期被逐漸激發(fā),且在盛食期達(dá)到最高,將眠時(shí)被逐漸抑制,在眠期達(dá)到最低。隨著齡期的推進(jìn)DNA復(fù)制程度越來(lái)越高,在五齡三天時(shí)DNA復(fù)制活性達(dá)到最高,且在五齡末期后部絲腺細(xì)胞先停止DNA復(fù)制,隨后是中部絲腺和前部絲腺細(xì)胞。另外,利用熒光定量PCR對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)基因在家蠶幼蟲(chóng)期絲腺中的表達(dá)情況進(jìn)行分析,結(jié)果顯示細(xì)胞周期相關(guān)基因在絲腺中的表達(dá)變化與家蠶幼蟲(chóng)期絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制的波動(dòng)趨勢(shì)基本一致。家蠶幼蟲(chóng)期絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制的這種變化趨勢(shì),表明絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制與調(diào)控家蠶幼蟲(chóng)發(fā)育的因素相關(guān)。因此,我們推測(cè)蛻皮激素、保幼激素和營(yíng)養(yǎng)可能參與調(diào)控絲腺細(xì)胞核內(nèi)有絲分裂。2.激素和饑餓對(duì)絲腺細(xì)胞核內(nèi)有絲分裂的調(diào)控研究我們選擇家蠶四齡幼蟲(chóng)作為激素和饑餓處理的材料,通過(guò)體內(nèi)注射和體外培養(yǎng)方法結(jié)合BrdU標(biāo)記技術(shù),發(fā)現(xiàn)體內(nèi)注射蛻皮激素(20E)后絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制被逐漸抑制,體外培養(yǎng)添加20E后絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制沒(méi)有變化：無(wú)論體內(nèi)注射還是體外培養(yǎng)處理,保幼激素(JH)對(duì)絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制都沒(méi)有影響,表明JH不能激發(fā)絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制。以上研究結(jié)果表明在家蠶幼蟲(chóng)體內(nèi)20E能抑制絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制,說(shuō)明在家蠶幼蟲(chóng)將眠和眠期時(shí)絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制被逐漸抑制受體內(nèi)蛻皮激素的調(diào)控。饑餓處理后絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制被抑制,重新喂食后又被激發(fā),再饑餓后又被抑制,再次添食桑葉后絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制重新被激發(fā)。饑餓處理后家蠶幼蟲(chóng)血淋巴中海藻糖和氨基酸的含量發(fā)生了變化。通過(guò)注射海藻糖、氨基酸、葡萄糖或三者混合物至饑餓處理后的家蠶幼蟲(chóng)體內(nèi),研究發(fā)現(xiàn)它們都不能重新激發(fā)絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制,表明單一營(yíng)養(yǎng)因子不能激發(fā)絲腺DNA復(fù)制。以上研究結(jié)果說(shuō)明蛻皮間期絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制被激發(fā)與家蠶幼蟲(chóng)大量進(jìn)食桑葉有關(guān)。3.胰島素信號(hào)對(duì)絲腺細(xì)胞核內(nèi)有絲分裂的調(diào)控研究通過(guò)體內(nèi)注射和體外培養(yǎng)方法結(jié)合BrdU標(biāo)記技術(shù),發(fā)現(xiàn)胰島素能激發(fā)絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制。通過(guò)體外培養(yǎng)添加信號(hào)通路特異抑制劑處理,發(fā)現(xiàn)PI3K信號(hào)通路、TOR信號(hào)通路和ERK信號(hào)通路都參與絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制的調(diào)控。通過(guò)體外培養(yǎng)添加胰島素和上述各信號(hào)通路抑制劑處理,再結(jié)合BrdU標(biāo)記技術(shù)和Western Blot分析,發(fā)現(xiàn)PI3K信號(hào)通路和TOR信號(hào)通路協(xié)同介導(dǎo)胰島素對(duì)家蠶幼蟲(chóng)絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制的激發(fā),且PI3K信號(hào)通路位于TOR信號(hào)通路的上游；胰島素不能激發(fā)ERK信號(hào)通路,推測(cè)其可能受到其他因子的調(diào)控。另外,Western Blot分析結(jié)果表明體內(nèi)注射20E處理和饑餓處理都能抑制P13K信號(hào)通路和TOR信號(hào)通路,說(shuō)明胰島素信號(hào)通路也參與20E和饑餓對(duì)家蠶幼蟲(chóng)絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制的調(diào)控。4.定量蛋白組學(xué)分析家蠶幼蟲(chóng)眠期和盛食期絲腺組織差異表達(dá)蛋白我們利用iTRAQ標(biāo)記方法結(jié)合質(zhì)譜技術(shù),鑒定了家蠶幼蟲(chóng)眠期和盛食期絲腺組織差異表達(dá)蛋白,共鑒定到蛋白4170個(gè),差異蛋白181個(gè),盛食期的與眠期的相比,上調(diào)蛋白71個(gè),下調(diào)蛋白110個(gè)。對(duì)鑒定到的差異蛋白進(jìn)行GO分析,發(fā)現(xiàn)分子功能注釋中9個(gè)條目和生物學(xué)過(guò)程中19個(gè)條目發(fā)生了改變。將差異蛋白在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Pathway顯著性富集分析,發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白富集到115個(gè)不同的生化途徑和信號(hào)通路中,說(shuō)明盛食期的絲腺細(xì)胞與眠期的相比其生理生化發(fā)生明顯的改變；此外,37%的差異蛋白富集到脂類、碳水化合物等代謝通路當(dāng)中,說(shuō)明能量代謝相關(guān)途徑也發(fā)生了明顯的改變。我們進(jìn)一步篩選了與細(xì)胞周期相關(guān)的15個(gè)信號(hào)通路,對(duì)富集到其中的差異表達(dá)基因進(jìn)行了驗(yàn)證和分析,并對(duì)發(fā)生最顯著差異的Pathway中差異倍數(shù)最大的基因(SilkDB ID:BGIBMGA005826)做了進(jìn)一步研究。GO分析和KEGG Pathway富集分析顯示,該基因參與脂類代謝,且與癌癥發(fā)生相關(guān)。家蠶基因芯片數(shù)據(jù)分析和熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明,該基因在家蠶五齡三天絲腺組織中特異高表達(dá),并且在家蠶幼蟲(chóng)絲腺中的表達(dá)變化與絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制波動(dòng)趨勢(shì)基本一致,因此,我們猜測(cè)該基因可能與絲腺細(xì)胞高效核內(nèi)有絲分裂調(diào)控相關(guān)。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示,該基因包含一個(gè)保守的昆蟲(chóng)類型的短鏈脫氫酶結(jié)構(gòu)域(ADH_SDR_c_like),屬于經(jīng)典類型的短鏈脫氫酶超家族,在結(jié)構(gòu)域上含有4個(gè)活性位點(diǎn)和19個(gè)NAD(P)結(jié)合位點(diǎn),故將其命名為BmADH,推測(cè)其與能量代謝通路相關(guān)。然后,我們進(jìn)一步對(duì)BmADH基因的功能進(jìn)行了分析。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示BmADH基因定位于胞質(zhì)中。在家蠶胚胎細(xì)胞系中干涉BmADH基因后能抑制TOR信號(hào)通路并抑制DNA復(fù)制。熒光定量PCR和免疫印跡檢測(cè)結(jié)果表明,體內(nèi)注射20E處理和饑餓處理后絲腺中BmADH基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào),說(shuō)明BmADH基因的表達(dá)受到蛻皮激素和營(yíng)養(yǎng)的調(diào)控。以上研究結(jié)果不僅從側(cè)面驗(yàn)證了20E、饑餓和胰島素信號(hào)對(duì)家蠶幼蟲(chóng)絲腺細(xì)胞核內(nèi)DNA復(fù)制的調(diào)控,也為進(jìn)一步研究絲腺細(xì)胞高效核內(nèi)有絲分裂的調(diào)控機(jī)制提供了新的方向。
【關(guān)鍵詞】：家蠶 絲腺 核內(nèi)有絲分裂 激素 胰島素信號(hào)
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S881.24
【目錄】：

• 摘要8-11
• ABSTRACT11-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-31
• 1.1 家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育與激素調(diào)控15-17
• 1.1.1 家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育15-16
• 1.1.2 家蠶的激素調(diào)控16-17
• 1.2 家蠶絲腺的發(fā)育17-18
• 1.2.1 家蠶絲腺組織特征17-18
• 1.2.2 激素與絲蛋白合成18
• 1.3 核內(nèi)有絲分裂調(diào)控的研究18-25
• 1.3.1 細(xì)胞周期概述18-20
• 1.3.2 哺乳動(dòng)物核內(nèi)有絲分裂20-21
• 1.3.3 果蠅核內(nèi)有絲分裂21-25
• 1.3.4 家蠶絲腺核內(nèi)有絲分裂25
• 1.4 胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究25-31
• 1.4.1 哺乳動(dòng)物胰島素信號(hào)通路25-27
• 1.4.2 昆蟲(chóng)胰島素信號(hào)通路27-28
• 1.4.3 果蠅胰島素信號(hào)通路與核內(nèi)有絲分裂28-31
• 第二章 引言31-35
• 2.1 研究背景與目的意義31-32
• 2.2 主要研究?jī)?nèi)容32-33
• 2.3 主要技術(shù)路線33-35
• 第三章 激素和饑餓對(duì)家蠶幼蟲(chóng)絲腺細(xì)胞核內(nèi)有絲分裂的調(diào)控35-55
• 3.1 材料與方法35-42
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料35
• 3.1.2 主要試劑及溶液配制35-37
• 3.1.3 主要儀器37-38
• 3.1.4 主要實(shí)驗(yàn)方法38-42
• 3.2 結(jié)果與分析42-51
• 3.2.1 家蠶幼蟲(chóng)期絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制情況分析42-44
• 3.2.2 細(xì)胞周期相關(guān)基因mRNA在家蠶幼蟲(chóng)絲腺組織中的表達(dá)分析44-45
• 3.2.3 蛻皮激素處理對(duì)家蠶幼蟲(chóng)絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制的影響45-47
• 3.2.4 保幼激素處理對(duì)家蠶幼蟲(chóng)絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制的影響47-48
• 3.2.5 營(yíng)養(yǎng)對(duì)家蠶幼蟲(chóng)絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制的影響48-51
• 3.3 討論51-54
• 3.3.1 家蠶幼蟲(chóng)期絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制變化趨勢(shì)解析51-53
• 3.3.2 20E和饑餓抑制絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制解析53-54
• 3.4 小結(jié)54-55
• 第四章 胰島素信號(hào)對(duì)家蠶幼蟲(chóng)絲腺細(xì)胞核內(nèi)有絲分裂的調(diào)控55-71
• 4.1 材料與方法55-59
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料55
• 4.1.2 主要試劑及溶液配制55-57
• 4.1.3 主要儀器57
• 4.1.4 主要實(shí)驗(yàn)方法及步驟57-59
• 4.2 結(jié)果與分析59-68
• 4.2.1 胰島素對(duì)家蠶幼蟲(chóng)絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制的影響60-61
• 4.2.2 LY294002、Rapamycin和U0126特異抑制劑處理后對(duì)絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制的影響61-64
• 4.2.3 胰島素信號(hào)在絲腺細(xì)胞中的傳遞路徑64-66
• 4.2.4 20E對(duì)絲腺細(xì)胞PI3K信號(hào)通路和TOR信號(hào)通路的調(diào)控66-67
• 4.2.5 饑餓對(duì)絲腺細(xì)胞PI3K信號(hào)通路和TOR信號(hào)通路的調(diào)控67-68
• 4.3 討論68-70
• 4.3.1 胰島素激發(fā)家蠶幼蟲(chóng)絲腺細(xì)胞DNA復(fù)制解析68-69
• 4.3.2 胰島素信號(hào)在絲腺中的傳遞路徑解析69-70
• 4.4 小結(jié)70-71
• 第五章 基于iTRAQ技術(shù)分析家蠶幼蟲(chóng)眠期和盛食期絲腺組織差異表達(dá)蛋白71-99
• 5.1 材料與方法71-79
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料71
• 5.1.2 主要試劑及溶液配制71-73
• 5.1.3 主要儀器73-74
• 5.1.4 主要實(shí)驗(yàn)方法及步驟74-79
• 5.2 結(jié)果與分析79-95
• 5.2.1 家蠶幼蟲(chóng)絲腺組織表達(dá)蛋白分析79-81
• 5.2.2 家蠶幼蟲(chóng)眠期和盛食期絲腺組織差異表達(dá)蛋白分析81-82
• 5.2.3 差異蛋白的pathway富集分析82-83
• 5.2.4 細(xì)胞周期相關(guān)差異蛋白的組織表達(dá)譜分析83-86
• 5.2.5 BGIBMGA005826/BmADH基因克隆與序列分析86-88
• 5.2.6 BmADH基因在家蠶幼蟲(chóng)期絲腺組織中表達(dá)水平分析88-89
• 5.2.7 BmADH基因的亞細(xì)胞定位89
• 5.2.8 干涉或過(guò)表達(dá)BmADH基因后對(duì)家蠶細(xì)胞DNA復(fù)制的影響89-92
• 5.2.9 干涉BmADH基因后對(duì)家蠶細(xì)胞TOR信號(hào)通路的影響92
• 5.2.10 20E對(duì)絲腺中BmADH基因表達(dá)的影響92-94
• 5.2.11 饑餓對(duì)絲腺中BmADH基因表達(dá)的影響94-95
• 5.3 討論95-98
• 5.4 小結(jié)98-99
• 第六章 綜合與結(jié)論99-101
• 論文創(chuàng)新點(diǎn)101-103
• 參考文獻(xiàn)103-117
• 附錄117-119
• 致謝119-121
• 在讀期間發(fā)表論文及參研課題情況121-122

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 沈飛英;鐘伯雄;樓程富;洪波;蔣振東;蘇松坤;梁建設(shè);徐海圣;;家蠶5齡幼蟲(chóng)不同時(shí)期中部絲腺細(xì)胞蛋白質(zhì)雙向電泳分析[J];蠶業(yè)科學(xué);2006年01期

2 魯華云;葉鍵;李建營(yíng);鐘伯雄;;家蠶不同品種后部絲腺蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜比較[J];蠶業(yè)科學(xué);2006年01期

3 吳衛(wèi)成;葉鍵;魯華云;李建營(yíng);陳金娥;孟智啟;倪春霄;鐘伯雄;;家蠶五齡第1天與第4天后部絲腺蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜比較[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2006年07期

  本文關(guān)鍵詞：家蠶幼蟲(chóng)絲腺細(xì)胞核內(nèi)有絲分裂的調(diào)控因素及相關(guān)蛋白的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：312768