本文關(guān)鍵詞：功能性氨基酸對豬上皮細胞蛋白周轉(zhuǎn)及母豬繁殖性能的作用機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：作為三大主要營養(yǎng)物質(zhì)之一的蛋白質(zhì)在機體代謝和生長發(fā)育中有著重要的作用,是影響畜禽生長發(fā)育和胴體構(gòu)成的主要營養(yǎng)因素。飼料蛋白在進入畜禽消化道后,在小腸部位被多種消化酶酶解為各種氨基酸和多肽,而后被消化系統(tǒng)轉(zhuǎn)運吸收,其中多肽在細胞中最終被分解成氨基酸,并進一步被利用。蛋白質(zhì)營養(yǎng)其實質(zhì)是氨基酸營養(yǎng)。傳統(tǒng)營養(yǎng)學將氨基酸劃分為必需氨基酸和非必需氨基酸兩大類。一直以來,必需氨基酸一直是動物營養(yǎng)研究的焦點,而非必需氨基酸的營養(yǎng)作用研究未得到營養(yǎng)學家們的重視。近期的研究發(fā)現(xiàn),在目前豬飼喂方式和營養(yǎng)需求標準下,“非必需氨基酸”并不能滿足自身生長、泌乳、健康的需要。目前,有關(guān)功能性氨基酸對腸道健康以及腸道蛋白質(zhì)合成的作用已有報道,而對其詳細的代謝通路的作用機制卻不清楚；功能性氨基酸對泌乳豬乳腺細胞蛋白質(zhì)的代謝以及相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)也鮮有報道。因此本研究結(jié)合以往的研究,以豬腸上皮細胞(IPEC-1)和豬乳腺上皮細胞(PMEC)為研究對象,重點研究部分功能性氨基酸,分別為精氨酸(Arg)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、脯氨酸(Pro),對細胞增殖／蛋白合成、蛋白質(zhì)降解以及相關(guān)信號通路的影響,結(jié)果將為功能性氨基酸在養(yǎng)豬業(yè)的應用提供必要的理論基礎和數(shù)據(jù)支持。1泌乳性能差異母豬血清代謝組分析本試驗旨在通過代謝組學手段對比分析泌乳性能優(yōu)異和較差的母豬血清差異,來尋找和確定能夠反映泌乳性能差異的標志性代謝物。試驗選取遺傳背景相同,胎次相近,泌乳性能不同的哺乳母豬并收集血漿樣本16例,分為A組(泌乳性能較好)和B組(泌乳性能較差),每組8例樣本,對采集的樣本進行LC-MS檢測分析,針對檢測結(jié)果,組間對比并進行差異代謝物篩選及鑒定。我們篩選鑒定出了以氨基酸,非飽和脂肪酸,有機酸,神經(jīng)遞質(zhì)為主的差異代謝物,其中氨基酸主要包括：精氨酸,高精氨酸(A組高于B組,P0.05)；脯氨酸,亮氨酸(A組低于B組,P0.05)；非飽和脂肪酸包括：油酸,亞油酸(A組高于B組,P0.05)；有機酸包括：蘋果酸,琥珀酸(A組高于B組,P0.05)；神經(jīng)遞質(zhì)：多巴胺(A組低于B組,P0.05)。差異代謝物均以PLS-DA模型的VIP (Variable Importance in the Projection)值作為鑒定依據(jù)(閾值均1),其中以精氨酸最為突出,泌乳性能較好的母豬血漿中的精氨酸含量是泌乳性能差的母豬血漿中精氨酸含量1.397倍,P=0.003,說明精氨酸在母豬泌乳過程中的重要性。2 Arg, Glu, Gln, Pro對腸上皮細胞蛋白質(zhì)代謝及信號通路的影響以豬IPEC-1為研究對象,首先將1×104活細胞接種于含有0.5mLDMEM完全培養(yǎng)基的24孔細胞培養(yǎng)板中,于37℃培養(yǎng)過夜,然后更換本試驗選用的4種功能性氨基酸濃度分別為OmM,0.06 mM,0.12 mM,0.24 mM的特殊培養(yǎng)基,在第0、2、4、6天分別獲取不同濃度及不同種類功能性氨基酸處理的培養(yǎng)細胞,進行細胞計數(shù)操作,測定4種功能性氨基酸對豬腸道上皮細胞增殖的影響。結(jié)果表明,Arg, Glu, Gln, Pro四種氨基酸都可以促進細胞的增殖,且Arg的效果最好。根據(jù)細胞增殖的結(jié)果,選取并考察了不同濃度精氨酸對腸道上皮細胞中蛋白質(zhì)合成以及相關(guān)信號通路中的關(guān)鍵信號蛋白的表達量及磷酸化的影響,同時為了考察NO合成酶在其中的作用,本實驗設計了10μM、100μM、350μM、100μM+L-NAME(NO合成酶抑制劑)和350μM+L-NAME5個處理組進行細胞培養(yǎng),實驗結(jié)果表明,當培養(yǎng)基中精氨酸濃度分別為10μM、100μM和350μM時,100μM和350gM處理組中mTOR、4EBP1和p70S6磷酸化水平顯著高于10μM精氨酸處理組(P0.05)；相同精氨酸濃度下,添加NO合成酶抑制劑對的mTOR、4EBP1和p70S6K蛋白的磷酸化起抑制作用(P0.05),但其磷酸化蛋白表達水平仍顯著高于10gM精氨酸處理組(P0.05)；各處理組mTOR和4EBP1蛋白表達水平差異均不顯著(P0.05)。100μM和350 gM精氨酸處理組p-P13K、Akt、p-Akt和Bcl-2蛋白表達水平均顯著高于10μM精氨酸處理組(P0.05)；與100gM精氨酸處理組相比,100μM Arg+L-NAME處理組的p-PI3K、Akt、p-Akt和Bcl-2蛋白表達水平均顯著降低(P0.05)；與350μM精氨酸處理組相比,350μM Arg+L-NAME處理組p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達水平也顯著降低(P0.05)。3 Arg對乳腺細胞蛋白質(zhì)合成及信號通路的影響通過體外培養(yǎng)豬乳腺上皮細胞,檢測了Arg對母豬乳腺上皮細胞增殖的調(diào)節(jié)作用及其機制,在木試驗可知,培養(yǎng)液中添加Arg處理后,細胞生長良好。Arg對乳腺上皮細胞增殖具有明顯的促進作用,與對照組相比,添加0.5倍(0.25mM/L)和1倍(0.5mM/L)的精氨酸在整個培養(yǎng)階段對乳腺上皮細胞都具有促進增殖的作用。在試驗初始階段,各處理組細胞數(shù)量無差異(P0.05)；在第3天,與對照組相比,0.5倍和1倍處理組的細胞數(shù)量分別提高了17.6%(P0.05)和20.1%(P0.05)；在第5天0.5倍和1倍處理組的細胞數(shù)量比對照組分別高27.6%(P0.01)、29.3%(P0.01)；在第7天0.5倍和1倍處理組的細胞數(shù)量比對照組分別高33.1%(P0.01)和34.3%(P0.01),表明當精氨酸濃度添加量為0.5mM/L時對細胞生長有顯著的促進作用,但是繼續(xù)添加精氨酸對生長的促進作用不明顯。Arg 2倍組中α-酪蛋白合成量高于其他各組(P0.05)。在Arg 0倍組到Arg 1倍組,隨著精氨酸濃度的升高,α-酪蛋白的合成量也呈升高的趨勢；在Arg2倍組到Arg8倍組,隨著精氨酸濃度的升高,a-酪蛋白的合成量呈下降的趨勢。p-酪蛋白的合成規(guī)律和αα-酪蛋白基本一致,當Arg2倍組時,p-酪蛋白的合成量最高,且與其他組相比差異顯著(P0.05)。對于mTOR、S6K基因,Arg各處理組均上調(diào)了其表達,差異顯著(P0.05),且在Arg 2倍組時各基因的相對表達量最高。對于4EBP1基因,Arg各處理組的表達均顯著下調(diào),說明Arg處理后抑制了其表達。4 Arg, Glu, Gin, Pro對母豬繁殖性能的影響參照已有研究的添加劑量,通過在依據(jù)NRC(2012)營養(yǎng)標準配制的懷孕母豬料與哺乳母豬料配方的基礎上分別添加1%的Arg, Glu, Gln, Pro,評估四種功能性氨基酸的分別添加對母豬產(chǎn)仔數(shù)等繁殖性能指標的影響。日糧添加Arg, Glu, Gln有效改善了母豬的繁殖性能,與對照組相比,日糧添加Arg, Glu, Gln增加了窩產(chǎn)活仔數(shù)(P0.05)和初生窩重以及斷奶重(P0.05),而日糧添加Pro對窩產(chǎn)仔數(shù)和初生窩重沒有影響。日糧分別添加Arg, Glu, Gln, Pro對母豬平均日采食量無任何影響。與對照組相比,日糧分別添加Arg, Glu, Gln, Pro縮短了全期試驗母豬發(fā)情間隔(P0.05)。精氨酸組提高全期母豬發(fā)情率4.11個百分點,但無顯著差異(P0.05)。
【關(guān)鍵詞】：功能性氨基酸 腸道上皮細胞 乳腺上皮細胞 蛋白周轉(zhuǎn) 信號通路
【學位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S828.5
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 第1章 文獻綜述14-25
• 1.1 功能性氨基酸的概念14-15
• 1.2 氨基酸與腸道健康15-18
• 1.2.1 精氨酸與腸道健康15-16
• 1.2.2 谷氨酸與腸道健康16
• 1.2.3 谷氨酰胺與腸道健康16-18
• 1.2.4 脯氨酸與腸道健康18
• 1.3 氨基酸對乳蛋白合成的調(diào)控18-24
• 1.3.1 支鏈氨基酸對乳蛋白合成的調(diào)控20-22
• 1.3.2 精氨酸對乳蛋白合成的調(diào)控22-23
• 1.3.3 谷氨酰胺和脯氨酸對乳蛋白合成的調(diào)控23-24
• 1.4 研究目的與意義24-25
• 第2章 泌乳性能差異母豬血清代謝組學分析25-36
• 2.1 材料與方法25-28
• 2.1.1 試驗動物和日糧25-26
• 2.1.2 泌乳性能的評定分組與采樣26
• 2.1.3 材料試劑26
• 2.1.4 樣品處理26-27
• 2.1.5 LC/MS分析27-28
• 2.1.6 數(shù)據(jù)的分析28
• 2.2 結(jié)果分析28-33
• 2.2.1 PCA分析28-29
• 2.2.2 PLS-DA分析29-31
• 2.2.3 兩組之間差異性代謝產(chǎn)物31-33
• 2.3 討論33-35
• 2.4 小結(jié)35-36
• 第3章 ARG,GLU,GLN,PRO對腸上皮細胞蛋白質(zhì)代謝及信號通路的影響36-45
• 3.1 材料與方法37-40
• 3.1.1 試驗儀器37
• 3.1.2 試驗試劑37
• 3.1.3 IPEC-1細胞培養(yǎng)37-38
• 3.1.4 試驗操作38-39
• 3.1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析39-40
• 3.2 結(jié)果與分析40-42
• 3.2.1 Arg,Glu,Gln,Pro對豬腸上皮細胞增殖的影響40
• 3.2.2 精氨酸對mTOR和PI3K-Akt-Bcl-2信號通路的影響40-42
• 3.3 討論42-44
• 3.4 小結(jié)44-45
• 第4章 ARG對豬乳腺上皮細胞(PMEC)蛋白質(zhì)合成及信號通路的影響45-53
• 4.1 材料與方法46-47
• 4.1.1 材料46
• 4.1.2 豬乳腺上皮細胞的培養(yǎng)和計數(shù)46
• 4.1.3 精氨酸對豬乳腺上皮細胞生長和細胞蛋白濃度的影響46
• 4.1.4 乳腺上皮細胞內(nèi)αS-1、β-酪蛋白合成量的測定46-47
• 4.1.5 精氨酸對豬乳腺上皮細胞mTOR信號通路翻譯起始因子基因表達的影響47
• 4.1.6 數(shù)據(jù)處理47
• 4.2 結(jié)果與分析47-51
• 4.2.1 精氨酸對豬乳腺上皮細胞增殖及蛋白濃度的影響47-48
• 4.2.2 精氨酸對豬乳腺上皮細胞內(nèi)酪蛋白合成的影響48-49
• 4.2.3 精氨酸對豬乳腺上皮細胞mTOR信號通路信號分子mRNA基因表達的影響49-51
• 4.3 討論51-52
• 4.3.1 精氨酸對豬乳腺上皮細胞增殖及蛋白合成的影響51-52
• 4.3.2 Arg對乳腺細胞中mTOR信號通路相關(guān)基因表達的影響52
• 4.4 小結(jié)52-53
• 第5章 日糧添加ARG,GLU,GLN,PRO對母豬繁殖性能的影響53-58
• 5.1 材料與方法53-55
• 5.1.1 試驗動物及設計53
• 5.1.2 試驗日糧53-54
• 5.1.3 飼養(yǎng)管理54
• 5.1.4 測定指標54-55
• 5.1.5 統(tǒng)計分析55
• 5.2 結(jié)果與分析55-56
• 5.2.1 日糧中添加Arg,Glu,Gln,Pro對母豬繁殖性能的影響55
• 5.2.2 日糧分別添加Arg,Glu,Gln,Pro對母豬采食量的影響55-56
• 5.2.3 日糧分別添加Arg,Glu,Gln,Pro對母豬全期發(fā)情間隔及斷奶后56
• 5.3 討論56-57
• 5.4 小結(jié)57-58
• 第6章 結(jié)論、創(chuàng)新性和展望58-59
• 6.1 主要結(jié)論58
• 6.2 創(chuàng)新性58
• 6.3 有待進一步研究的問題58-59
• 參考文獻59-71
• 附表：縮寫詞表(ABBROVIATIONS)71-72
• 致謝72-73
• 作者簡介73
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文和申請的專利73

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