本文關(guān)鍵詞：BmGem1和BmGem2在家蠶細胞中的功能鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細胞周期活動是一個普遍而又非常復雜的級聯(lián)調(diào)控過程,它與細胞的增殖和分化、DNA的損傷和修復以及個體的發(fā)育、器官的形成、壞死組織的再生和疾病的發(fā)生密切相關(guān)。多細胞生物的正常發(fā)育依賴于細胞增殖及分化的一系列嚴密調(diào)控過程,研究表明多種蛋白在這一過程中起著非常重要的作用。Geminin蛋白就是其中一種,它是1998年首先在爪蟾卵的抽提物中被鑒定到的一個不穩(wěn)定小分子核蛋白。Geminin包含一段特殊的coiled-coil超螺旋二級結(jié)構(gòu),通過競爭性結(jié)合DNA復制起始因子Cdt1或多種參與細胞分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,調(diào)控個體發(fā)育過程中細胞的增殖和分化。目前,Geminin作為偶聯(lián)細胞增殖與分化的一個關(guān)鍵的周期調(diào)控因子已經(jīng)成為研究熱點。本研究在本實驗室已克隆并鑒定的兩個家蠶Geminin基因,BmGem1和BmGem2以及復制起始因子BmCdt1的基礎(chǔ)上,利用免疫共沉淀、雙分子熒光互補技術(shù)、基因干擾和過表達技術(shù)以及酵母雙雜交技術(shù)等多種分子細胞生物學研究方法對其在細胞中的功能展開深入的研究,這將為家蠶細胞周期調(diào)控的研究奠定基礎(chǔ),并且能夠豐富細胞生物學相關(guān)理論。獲得的主要研究結(jié)果如下：1. BmGem1、BmGem2與BmCdt1之間的相互作用關(guān)系本研究通過雙分子熒光互補技術(shù)(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)的方法對BmGeml1、BmGem2以及BmCdt1蛋白之間的相互作用關(guān)系進行檢測。在家蠶卵巢細胞系BmN-SWU1中BiFC和Co-IP結(jié)果表明：BmGem1和BmGem2在細胞核中自身都能相互作用,并且BmGem1和BmGem2之間也存在相互作用；在細胞核中BmGem1能與BmCdt1發(fā)生相互作用,而BmGem2不能與BmCdt1發(fā)生相互作用,但是BmGem2能在細胞質(zhì)中與BmCdt1發(fā)生相互作用。另外,Co-IP檢測結(jié)果顯示：當BmGem1、BmGem2和BmCdt1在家蠶BmN-SWU1細胞中共同轉(zhuǎn)染時,在細胞質(zhì)中BmGem1與BmGem2都能與BmCdt1發(fā)生相互作用,不存在相互競爭結(jié)合的關(guān)系,在細胞核中BmGeml與BmCdtl能發(fā)生相互作用,而BmGem2不能與BmCdt1相互作用。這些研究結(jié)果表明,BmGem1是家蠶細胞直接與BmCdt1相互作用的Geminin蛋白直系同源物,而BmGem2在細胞周期調(diào)控中的作用以及執(zhí)行的功能的分子機制可能與Geminin蛋白存在差異。2. BmGeml和BmGem2干涉對家蠶細胞的影響利用基于家蠶miRNA-based的RNAi載體在家蠶卵巢細胞系BmN4細胞中對BmGeml和BmGem2表達進行敲降。qRT-PCR檢測結(jié)果表明BmN4細胞中轉(zhuǎn)染BmGem1RNAi載體后,在對照組(con1RNAi) BmGeml和BmGem2基因表達量為1的基礎(chǔ)上,BmGem1的mRNA水平下降為0.39±0.01,BmGem2的mRNA水平則升高為1.28±0.01；而轉(zhuǎn)染BmGem2 RNAi后在對照組(con2RNAi) BmGem2和BmGem1基因表達量為1的基礎(chǔ)上,qRT-PCR檢測結(jié)果表明BmGem2的mRNA水平下降為0.61±0.07,BmGem1的mRNA水平則升高為1.66±0.04,同時干涉BmGem1和BmGem2后在對照組(conRNAi) BmGem1和BmGem2基因表達量為1的基礎(chǔ)上, qRT-PCR檢測結(jié)果表明BmGem1的mRNA水平下降為0.78±0.05,BmGem2的:nRNA水平下降為0.68±0.06,這些研究結(jié)果表明兩者之間存在一定的劑量補償?shù)年P(guān)系,暗示兩個蛋白雖然與BmCdt1作用機制存在差異,但在家蠶細胞中的功能仍然存在一定關(guān)聯(lián)。BmN4細胞中BmGem1干涉后細胞體積明顯的增大,統(tǒng)計分析結(jié)果表明BmGem1干涉組中有58.35%左右的細胞體積增大,對照組中僅有5.24%左右的細胞體積增大的細胞；BmGem2干涉組中未發(fā)現(xiàn)有明顯的細胞體積增大的現(xiàn)象；但是同時干涉BmGem1和BmGem2后細胞體積增大的現(xiàn)象更為顯著,達到被干涉細胞的87.35%左右,顯著高于BmGem1單獨干涉組。細胞增殖活性檢測結(jié)果顯示BmGeml干涉的家蠶細胞中細胞增殖活性下降了36%左右,而BmGem2干涉的BmN4細胞中細胞增殖活性沒有明顯的變化；BmGeml和BmGem2共同干涉后細胞的增殖活性下降了53%左右,與BmGem1單獨干涉組相比增殖活性顯著下降。另外,流式細胞檢測結(jié)果表明,BmGem1干涉后誘發(fā)DNA重復復制現(xiàn)象,而BmGem2干涉則不能誘發(fā)這種現(xiàn)象。并且與單獨干涉BmGeml相比,BmGeml和BmGem2共同干涉后誘發(fā)家蠶細胞DNA重復復制現(xiàn)象更顯著。說明BmGeml蛋白在家蠶細胞中能與BmCdtl蛋白直接相互作用調(diào)控細胞中DNA復制的起始,細胞缺失BmGeml表達誘發(fā)DNA重復復制的發(fā)生,致使細胞核體積變大；BmGem2不能與BmCdt1直接相互作用,其缺失表達并不會導致細胞周期進程中DNA重復復制；而兩者同時缺失時抑制細胞增殖和誘發(fā)DNA重復復制能力增強,暗示BmGem2仍然參與調(diào)控細胞周期的相關(guān)過程,但BmGem2在細胞周期調(diào)控中的作用能夠被BmGem1替代。3. BmGeml和BmGem2過表達對家蠶細胞的影響在BmN4細胞中分別過表達BmGeml和BmGem2基因后,熒光顯微鏡下觀察單個細胞形態(tài)無明顯的變化；但是BmGem1過表達組與對照相比細胞密度明顯下降,細胞增殖活性檢測結(jié)果表明細胞增殖活性下降了40%左右；而BmGem2過表達后對細胞增殖活性沒有明顯的變化；細胞流式結(jié)果表明,BmGem1過表達后G1期的細胞數(shù)目沒有明顯的變化,S期的細胞數(shù)目顯著增加,G2/M期的細胞數(shù)目則顯著降低；而BmGem2過表達后各個時期的細胞數(shù)目都沒有明顯的變化。這表明BmGem1過表達使細胞周期阻滯在S期,而不能進入G2/M期,過表達BmGem1對細胞周期沒有明顯的影響。BmmN4細胞轉(zhuǎn)染BmGem1和BmGem1過表達載體后利用Brdu標記DNA復制起始情況,免疫熒光檢測結(jié)果顯示過表達BmGem1的細胞中具有DNA復制活性的細胞為0.16±0.09,對照組細胞為0.51±0.07,BmGem1過表達細胞的DNA合成活性顯著降低；而過表達BmGem2的DNA合成活性沒有顯著差異。過表達研究結(jié)果表明,BmGem1在家蠶細胞周期進程中起著關(guān)鍵作用,BmGem1過表達阻滯細胞周期進行并抑制細胞增殖：而BmGem2在細胞周期調(diào)控中的作用較弱,它的過表達對細胞周期進行及細胞增殖無顯著影響。4. BmGem2相互作用蛋白的篩選及鑒定我們的前期研究結(jié)果顯示,BmGem2在DNA復制起始及細胞周期調(diào)控中的作用與BmGem1蛋白存在顯著差異,為了精確分析BmGem2在家蠶細胞中執(zhí)行的相關(guān)功能,我們通過酵母雙雜交技術(shù)鑒定家蠶中與BmGem2相互作用的蛋白。利用胚胎期、5齡第3天、游走期以及化蛹期的整蠶的總RNA構(gòu)建家蠶酵母雙雜交文庫。并以BmGem2為誘餌蛋白,通過酵母雙雜交技術(shù)共篩選獲得能夠與BmGem2發(fā)生相互作用的陽性克隆34個,分別編碼23個基因,剔除這23個基因中因重組cDNA造成的移碼錯義的基因,最終我們獲得陽性克隆數(shù)是12個,隨后我們對這12個基因進行克隆鑒定。通過雙重免疫熒光檢測和免疫共沉淀方法,最終鑒定到4個基因(17號,21號,38號,39號)分別能夠與BmGem2共定位且產(chǎn)生相互作用。生物信息學分析結(jié)果顯示,17號和39號基因編碼的蛋白是家蠶中特異的蛋白,序列分析結(jié)果顯示在其它物種中未鑒定到其同源物。而21號基因編碼的蛋白是果蠅中Centrosomin蛋白的同源物,因此我們將21號基因命名為Bmcnn,研究表明Centrosomin參與細胞骨架調(diào)控并對于染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起著很重要作用,qRT-PCR檢測結(jié)果顯示Bmcnn在家蠶5齡第3天正在進行高強度有絲分裂的精巢和卵巢中高表達,而在核內(nèi)有絲分裂旺盛的絲腺中幾乎不表達,推測BmGem2可能與細胞染色體結(jié)構(gòu)的調(diào)控有關(guān)。39號基因編碼的蛋白是哺乳動物核糖體生物合成調(diào)控蛋白RRS1的同源物,我們將39號基因命名為BmRRS1, qRT-PCR檢測結(jié)果顯示BmRRS1在家蠶5齡第3天的各個組織都有表達,且在精巢、卵巢和絲腺中表達量較高,推測BmGem2可能與核糖體生物合成調(diào)控有關(guān)。這些研究結(jié)果表明,Geminin基因在鱗翅目中特異擴增產(chǎn)生的BmGem2的功能已經(jīng)發(fā)生分化,其在細胞中對于DNA復制及細胞周期進程的調(diào)控作用可能已經(jīng)減弱,而執(zhí)行調(diào)控染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及核糖體生物合成等新功能。
【關(guān)鍵詞】：家蠶 細胞周期 DNA重復復制 BmGem基因
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S881.2
【目錄】：

• 摘要8-12
• ABSTRACT12-16
• 第一章 文獻綜述16-30
• 1.1 細胞周期概述16
• 1.2 細胞周期的調(diào)控16-25
• 1.2.1 細胞周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶16-19
• 1.2.2 細胞周期調(diào)控因子對周期的調(diào)控19-20
• 1.2.3 DNA復制起始的調(diào)控20-25
• 1.3 細胞周期因子Geminin的功能25-29
• 1.3.1 Geminin蛋白25
• 1.3.2 Geminin蛋白的結(jié)構(gòu)域25-26
• 1.3.3 Geminin在復制起始中的功能26-28
• 1.3.4 Geminin在細胞周期中的作用28
• 1.3.5 Geminin在胚胎發(fā)育中的功能28-29
• 1.4 脊椎動物Geminin相似蛋白與細胞周期調(diào)控29-30
• 第二章 引言30-32
• 2.1 研究背景與目的意義30-31
• 2.2 主要研究內(nèi)容31
• 2.3 技術(shù)路線31-32
• 第三章 BmGem1,BmGem2與BmCdt1之間的相互作用32-50
• 3.1 材料與方法32-41
• 3.1.1 主要材料32
• 3.1.2 主要試劑及溶液配制32-35
• 3.1.3 主要儀器35-36
• 3.1.4 主要實驗方法及步驟36-41
• 3.2 結(jié)果與分析41-48
• 3.2.1 BiFC分析BmGem1、BmGem2和BmCdt1之間的相互作用41-42
• 3.2.2 免疫共沉淀分析BmGem1和BmGem2之間的相互作用42-45
• 3.2.3 免疫共沉淀分析BmGem1,BmGem2與BmCdt1的相互作用45-48
• 3.3 討論48-50
• 第四章 BmGem基因干涉對家蠶細胞影響50-64
• 4.1 材料與方法50-53
• 4.1.1 家蠶細胞系50
• 4.1.2 主要試劑及溶液配制50-51
• 4.1.3 主要儀器51
• 4.1.4 主要實驗方法及步驟51-53
• 4.2 結(jié)果與分析53-62
• 4.2.1 干涉質(zhì)粒載體構(gòu)建53-54
• 4.2.2 基因干涉效果檢測54-56
• 4.2.3 BmGem基因干涉后家蠶細胞體積大小的變化56-59
• 4.2.4 BmGem基因干涉對細胞增殖活性的影響59-60
• 4.2.5 BmGem基因干涉對細胞周期和DNA含量的影響60-62
• 4.3 討論62-64
• 第五章 BmGem基因過表達對家蠶細胞的影響64-74
• 5.1 材料與方法64-67
• 5.1.1 家蠶細胞系64
• 5.1.2 主要試劑及溶液配制64
• 5.1.3 實驗所需引物64-65
• 5.1.4 主要實驗方法及步驟65-67
• 5.2 結(jié)果與分析67-73
• 5.2.1 BmGem基因過表達載體的構(gòu)建67
• 5.2.2 BmGeml和BmGem2融合蛋白在家蠶細胞中的亞細胞定位67-68
• 5.2.3 BmGem過表達在家蠶細胞中相對表達量分析68-69
• 5.2.4 過表達BmGem基因?qū)毎螒B(tài)的影響69-70
• 5.2.5 過表達BmGem基因?qū)毎鲋郴钚缘挠绊?/span>70
• 5.2.6 過表達BmGem基因?qū)毎芷诘挠绊?/span>70-73
• 5.3 討論73-74
• 第六章 BmGem2相互作用蛋白的篩選及鑒定74-100
• 6.1 材料74-75
• 6.1.1 家蠶及家蠶細胞系74
• 6.1.2 主要試劑及溶液配制74-75
• 6.2 主要實驗方法及步驟75-89
• 6.2.1 RNA提取75-76
• 6.2.2 mRNA的分離76-77
• 6.2.3 DSN均一化Uncut cDNA初級文庫的構(gòu)建77-83
• 6.2.4 pGADT7-DEST酵母雙雜交文庫的構(gòu)建83-84
• 6.2.5 酵母雙雜交篩選BmGem2相互作用蛋白84-87
• 6.2.6 酵母雙雜交文庫篩選87
• 6.2.7 新基因克隆及載體構(gòu)建87-89
• 6.2.8 其它實驗步驟參照第三,四,五章節(jié)89
• 6.3 結(jié)果與分析89-99
• 6.3.1 家蠶DSN均一化酵母雙雜交cDNA文庫(三框型)構(gòu)建89-90
• 6.3.2 pGBKT7-BmGem2誘餌載體的構(gòu)建90-91
• 6.3.3 pGBKT7-BmGem2誘餌載體自激活檢測91
• 6.3.4 酵母雙雜交陽性克隆鑒定91-92
• 6.3.5 酵母陽性克隆質(zhì)粒提取和測序比對92-93
• 6.3.6 BmGem2相互作用蛋白的驗證93-97
• 6.3.7 新基因在5齡第3天家蠶各組織中的相對表達分析97-99
• 6.4 討論99-100
• 第七章 綜合與結(jié)論100-102
• 論文創(chuàng)新點102-104
• 參考文獻104-118
• 附錄118-120
• 在讀期間發(fā)表論文及參研課題120-122
• 致謝122-123

【共引文獻】

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