本文關(guān)鍵詞：黃鱔性逆轉(zhuǎn)相關(guān)基因的克隆及其調(diào)控機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本研究克隆獲得了黃鱔wt1、foxl2、dax1和amh基因的全長(zhǎng)序列,并分析了它們?cè)邳S鱔性腺不同發(fā)育時(shí)期以及不同組織間的表達(dá)差異。序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)wt1、foxl2、dax1在不同物種間保守性較高,而amh在不同物種間保守性并不高。18s、ef1α和rpl17為黃鱔性腺發(fā)育研究中穩(wěn)定的內(nèi)參基因,可以對(duì)目的基因進(jìn)行矯正。半定量研究結(jié)果表明,wt1和dax1基因廣泛分布在包括性腺在內(nèi)的多個(gè)組織中,說(shuō)明這兩個(gè)基因的功能比較復(fù)雜。而在性腺、腦和眼中能檢測(cè)到foxl2的表達(dá),表明該基因參與了魚(yú)類(lèi)眼部結(jié)構(gòu)的形成和發(fā)育。amh只局限在性腺中表達(dá),表明該基因?qū)π韵俚陌l(fā)育和分化具有重要作用。實(shí)時(shí)熒光定量和免疫組織化學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),wt1基因在三種性別的性腺中都有表達(dá),且wt1蛋白主要在精巢的支持細(xì)胞中表達(dá)以及只在卵巢的顆粒細(xì)胞中表達(dá),表明該基因不管是對(duì)精母細(xì)胞的生長(zhǎng)以及精子的成熟,還是對(duì)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟都起到了一定的作用;在雌性卵巢顆粒細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以及未成熟的卵母細(xì)胞中能檢測(cè)到foxl2蛋白的分布,并且在性腺中的表達(dá)量雌性間性雄性,foxl2蛋白也分布在間性性腺和雄性性腺的精巢間質(zhì)細(xì)胞中,表明卵母細(xì)胞的發(fā)育以及功能的維持需要foxl2的持續(xù)表達(dá),且它對(duì)雌雄同體魚(yú)類(lèi)的精巢功能的維持也起到重要的作用。相反,amh基因在性腺中的表達(dá)量雄性間性雌性,表明該基因的上調(diào)能夠啟動(dòng)黃鱔雄性支持細(xì)胞的分化,并且對(duì)黃鱔雄性的發(fā)育和精巢的維持具有一定的作用。dax1不管是在雌性、間性和雄性都有高水平的表達(dá),表明它與黃鱔卵巢的發(fā)育以及精巢的發(fā)育和維持有關(guān)。此外,這些基因也可以通過(guò)直接或間接調(diào)控cyp19a1a m RNA的表達(dá)來(lái)調(diào)控性腺的發(fā)育。本研究測(cè)定了HPG軸、HPT軸和HPI軸上相關(guān)激素和基因的表達(dá)。血清激素測(cè)定結(jié)果表明,雌二醇(E2)和皮質(zhì)醇激素在黃鱔性腺發(fā)育不同時(shí)期沒(méi)有明顯的變化趨勢(shì),表明E2和皮質(zhì)醇對(duì)性腺發(fā)育的影響可能還受到其受體基因的調(diào)控。但三碘甲狀腺原氨酸(T3)和游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)在雌性和雄性中表達(dá)量很高,但在間性中有顯著下降,表明甲狀腺激素可能參與黃鱔的性腺發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)過(guò)程的啟動(dòng)。對(duì)促性腺激素受體基因的研究顯示,fshr和lhr基因在隨著黃鱔性腺的發(fā)育都有先升高后降低,然后再升高的變化趨勢(shì)。lhr在產(chǎn)卵前期(雌性V期)表達(dá)量達(dá)到高峰,而fshr在雄性時(shí)期達(dá)到高峰,結(jié)果表明LH對(duì)誘導(dǎo)黃鱔卵母細(xì)胞的成熟和排卵有關(guān),且FSH和LH對(duì)調(diào)節(jié)早期精巢的發(fā)育,精子的發(fā)生以及成熟具有重要作用。star基因的表達(dá)模式與fshr類(lèi)似,表明star基因與黃鱔精巢的早期分化和精子的成熟有關(guān)。另外,star基因的表達(dá)和fshr基因的表達(dá)存在明顯的相關(guān)性,表明在黃鱔性腺發(fā)育過(guò)程中,star基因的表達(dá)可能受到FSH的調(diào)控。在對(duì)黃鱔vtg基因的表達(dá)模式研究中發(fā)現(xiàn),vtg基因主要在肝臟中表達(dá),特別是在雌性中,說(shuō)明黃鱔雌性卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程需要外源性的肝臟合成的卵黃蛋白原。卵巢發(fā)育從第III期到第IV期和V期時(shí),vtg基因在肝臟中的表達(dá)量顯著升高,表明肝臟中卵黃蛋白原基因表達(dá)量的升高與卵母細(xì)胞卵黃的積累和成熟相關(guān)。但隨著黃鱔卵母細(xì)胞的退化和精巢組織的發(fā)育,肝臟中卵黃蛋白原基因表達(dá)量顯著下降,待進(jìn)入雄性時(shí)期時(shí)基本檢測(cè)不到卵黃蛋白原的表達(dá),表明肝臟卵黃蛋白原合成量的減少有助于卵母細(xì)胞的退化和精巢發(fā)育的激活。另外,本研究還測(cè)定了黃鱔er基因的兩個(gè)亞型,erα和erβ,以及ar和gr基因在黃鱔性腺不同發(fā)育時(shí)期肝臟組織和性腺組織中的表達(dá)差異。研究表明,erα在肝臟的表達(dá)量高于erβ,表明erα比erβ在肝臟卵黃蛋白原的生成調(diào)節(jié)中具有更重要的作用。erα在肝臟中的表達(dá)量隨著卵黃的積累以及卵母細(xì)胞的成熟逐漸降低,表明E2對(duì)雌性黃鱔卵黃的積累的作用可能主要是通過(guò)erα來(lái)介導(dǎo)的,且隨著卵母細(xì)胞的成熟,E2誘導(dǎo)卵黃的積累作用減弱。但隨著卵母細(xì)胞的成熟,vtg的表達(dá)量顯著性升高,說(shuō)明卵黃的積累除了受到E2的誘導(dǎo)外還受到其它激素的干擾。在性腺中,erα的表達(dá)量隨著卵母細(xì)胞的成熟逐漸升高,說(shuō)明性腺卵母細(xì)胞的成熟與排卵可能需要一定水平的E2的刺激。當(dāng)性腺發(fā)育進(jìn)入間性時(shí)期,肝臟erα的表達(dá)量有所升高,可能是由于黃鱔卵母細(xì)胞發(fā)育不同步,進(jìn)入間性時(shí)期時(shí)仍需要持續(xù)的卵黃蛋白原的供應(yīng),而性腺中erα的表達(dá)量顯著降低,表明E2對(duì)性腺作用的減退有助于卵母細(xì)胞的退化和精巢組織的發(fā)育。但雄性性腺中erα也有高水平表達(dá),表明E2也參與了雄性性腺的發(fā)育和精巢的維持。ar的表達(dá)量在雌性和雄性黃鱔中都是隨著卵母細(xì)胞和精原細(xì)胞的發(fā)育與成熟表達(dá)量顯著升高,表明ar對(duì)黃鱔雌性性腺和雄性性腺的發(fā)育都起到了一定的作用。gr水平也是隨著性腺的發(fā)育表達(dá)量逐漸升高,特別在雄性性腺中g(shù)r的表達(dá)量顯著升高,表明皮質(zhì)醇對(duì)誘導(dǎo)黃鱔的雄性化具有一定的作用。
【關(guān)鍵詞】：黃鱔 性腺發(fā)育 性逆轉(zhuǎn) 性別相關(guān)基因 血清激素 卵黃蛋白原
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 縮略語(yǔ)表12-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-38
• 1 遺傳決定模式（Genetic sex determination，GSD）13-21
• 1.1 魚(yú)類(lèi)的染色體性別決定類(lèi)型13-14
• 1.2 魚(yú)類(lèi)性別決定與分化相關(guān)基因14-21
• 2 環(huán)境決定模式（Environmental sex determination，ESD）21-25
• 2.1 溫度和pH21-22
• 2.2 外源性干擾物22-24
• 2.3 社會(huì)地位及行為24-25
• 3 控制性別分化內(nèi)源激素的研究進(jìn)展25-32
• 3.1 下丘腦—垂體—性腺軸（HPG）與性腺發(fā)育25-29
• 3.2 下丘腦—垂體—甲狀腺軸（HPT）與性腺發(fā)育29-30
• 3.3 下丘腦—垂體—腎間組織軸（HPI）與性腺發(fā)育30-31
• 3.4 三軸之間的相互調(diào)控作用31-32
• 4 卵黃蛋白原與性腺發(fā)育32-35
• 4.1 卵黃蛋白原的合成32-33
• 4.2 激素與卵黃蛋白原合成33-35
• 5 魚(yú)類(lèi)性逆轉(zhuǎn)的研究進(jìn)展35-37
• 6 本研究的目的和意義37-38
• 第二章 黃鱔性腺發(fā)育不同時(shí)期內(nèi)參基因穩(wěn)定性研究38-54
• 1 前言38-39
• 2 材料及方法39-48
• 2.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)39
• 2.2 黃鱔組織樣品采集39-41
• 2.3 總RNA提取41-42
• 2.4 反轉(zhuǎn)錄42-43
• 2.5 引物設(shè)計(jì)43-44
• 2.6 ef1α 和rpl17 基因的克隆、測(cè)序及各基因標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建44-47
• 2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR47
• 2.8 數(shù)據(jù)分析47-48
• 3 結(jié)果48-51
• 3.1 Tukey’s HSD檢驗(yàn)48-49
• 3.2 Δ~( Ct)比較法49-50
• 3.3 BestKeeper50
• 3.4 GeNorm50-51
• 3.5 NormFind51
• 4 討論51-53
• 5 小結(jié)53-54
• 第三章 黃鱔性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中foxl2 和wt1 基因的克隆、表達(dá)差異以及蛋白定位研究54-74
• 1 前言54-55
• 2 材料及方法55-59
• 2.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)55
• 2.2 黃鱔組織樣品采集55
• 2.3 總RNA提取55
• 2.4 反轉(zhuǎn)錄55
• 2.5 引物設(shè)計(jì)55-56
• 2.6 wt1 和foxl2 基因的克隆、測(cè)序及各基因標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建56-57
• 2.7 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建57
• 2.8 半定量PCR57-58
• 2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR58
• 2.10 免疫組織化學(xué)58-59
• 3 結(jié)果59-70
• 3.1 Wt1 和Foxl2 cDNA序列的克隆結(jié)果及序列分析59-63
• 3.2 wt1 和foxl2 核苷酸序列進(jìn)化樹(shù)分析63-64
• 3.3 wt1 基因和foxl2 基因在各組織間的分布64-65
• 3.4 wt1 基因和foxl2 基因在黃鱔性腺不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異65-67
• 3.5 免疫組織化學(xué)法對(duì)Wt1 蛋白和Foxl2 在性腺中的表達(dá)進(jìn)行定位67-70
• 4 討論70-73
• 5 小結(jié)73-74
• 第四章 黃鱔性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中amh和dax1 基因的克隆、序列分析及其表達(dá)差異研究74-90
• 1 前言74-75
• 2 材料方法75-78
• 2.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)75
• 2.2 黃鱔組織樣品采集75
• 2.3 總RNA提取75
• 2.4 反轉(zhuǎn)錄75
• 2.5 引物設(shè)計(jì)75-76
• 2.6 amh和dax1 基因的克隆、測(cè)序及各基因標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建76-77
• 2.7 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建77
• 2.8 半定量PCR77
• 2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR77-78
• 3 結(jié)果78-86
• 3.1 Amh和Dax1 cDNA序列的克隆結(jié)果及序列分析78-82
• 3.2 amh和dax1 核苷酸序列進(jìn)化樹(shù)分析82-83
• 3.3 amh基因和dax1 基因在各組織間的分布83-84
• 3.4 amh基因和dax1 基因在黃鱔性腺不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異84-86
• 4 討論86-88
• 5 小結(jié)88-90
• 第五章 黃鱔性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中fshr、lhr和star基因表達(dá)差異以及性腺發(fā)育相關(guān)激素的測(cè)定90-105
• 1 前言90-91
• 2 材料及方法91-95
• 2.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)91
• 2.2 黃鱔組織樣品及血液的采集91-92
• 2.3 總RNA提取92
• 2.4 反轉(zhuǎn)錄92
• 2.5 引物設(shè)計(jì)92-94
• 2.6 fshr、lhr和srat基因的克隆、測(cè)序及各基因標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建94
• 2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR94-95
• 2.8 血清激素測(cè)定95
• 3 結(jié)果95-100
• 3.1 fshr、lhr和srat基因在黃鱔性腺不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異95-97
• 3.2 E2、皮質(zhì)醇、T3和FT3在黃鱔性腺不同發(fā)育時(shí)期的變化97-100
• 4 討論100-103
• 5 小結(jié)103-105
• 第六章 黃鱔性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中er、ar和gr基因表達(dá)差異與vtg基因表達(dá)相關(guān)性研究105-117
• 1 前言105-106
• 2 材料及方法106-109
• 2.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)106
• 2.2 黃鱔組織樣品采集106-107
• 2.3 總RNA提取107
• 2.4 反轉(zhuǎn)錄107
• 2.5 引物設(shè)計(jì)107
• 2.6 er、ar、gr和vtg基因的克隆、測(cè)序及各基因標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建107-108
• 2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR108-109
• 3 結(jié)果109-113
• 3.1 erα 和erβ 基因在黃鱔性腺不同發(fā)育時(shí)期肝臟和性腺組織中表達(dá)差異109-111
• 3.2 ar和gr基因在黃鱔性腺不同發(fā)育時(shí)期肝臟和性腺組織中表達(dá)差異111-112
• 3.3 vtg基因在黃鱔性腺不同發(fā)育時(shí)期肝臟和性腺組織中的表達(dá)差異112-113
• 4 討論113-116
• 5 小結(jié)116-117
• 參考文獻(xiàn)117-148
• 附錄148-149
• 致謝149-151

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本文編號(hào)：288428