近些年來,隨著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展,奶牛的單產(chǎn)水平逐年提升。然而隨之也帶來了很多問題,其中奶牛產(chǎn)后繁殖力下降最為突出。很多高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后出現(xiàn)不發(fā)情、發(fā)情表現(xiàn)不足或受胎率下降等情況,導致高產(chǎn)牛群后代數(shù)量下降,奶牛胎間距增大,養(yǎng)殖企業(yè)成本增加利潤下降。生殖激素對于調節(jié)奶牛發(fā)情周期和妊娠具有非常重要的作用,并且一直以來對其調節(jié)機制進行了大量研究和應用,但是盡管如此也沒有從根本上解決奶牛產(chǎn)后繁殖力下降的問題。奶牛在產(chǎn)后30天開始進入產(chǎn)奶高峰期,而直到產(chǎn)后90天奶牛才開始進入采食高峰期,這一段時期奶牛的能量就處于能量負平衡狀態(tài)。然而奶牛產(chǎn)后60至90天正是參配的最佳時期。有研究發(fā)現(xiàn),奶牛在泌乳期或營養(yǎng)不足的情況下,steroidogenic acute regulatory protein(St AR)基因的表達被下調。該基因被下調將直接導致卵巢孕酮合成水平下降,如果奶牛此時參配則將導致受胎率下降。這一研究結果提示,某些營養(yǎng)物質可能參與了奶牛產(chǎn)后發(fā)情和受孕的調節(jié)。低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL)一直以來被視為營養(yǎng)物質或類固醇激素合成底物。越來越多的研究證實低密度脂蛋白對孕酮合成具有刺激作用。而低密度脂蛋白調節(jié)St AR基因表達的證據(jù)僅在小鼠的非卵巢細胞中被發(fā)現(xiàn)。然而在顆粒細胞中低密度脂蛋白是否具有類似的調節(jié)St AR基因表達的作用仍未有報道。而對這一問題的研究將有助于理解體內(nèi)卵泡排卵后,低密度脂蛋白在顆粒細胞向黃體細胞分化過程中對其功能轉變的作用。本研究在體外培養(yǎng)牛顆粒細胞,利用含有低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)的DMEM/F12培養(yǎng)液處理顆粒細胞24h后與對照組(未添加低密度脂蛋白)進行比較。利用孕酮放免試劑盒分析兩組培養(yǎng)液中的孕酮含量,結果顯示低密度脂蛋白組產(chǎn)生的孕酮(155.61±35 ng/105細胞)明顯多于對照組(30.31±6.2ng/105細胞;p0.05);熒光定量PCR結果顯示,低密度脂蛋白上調了顆粒細胞St AR和P450scc的m RNA表達量,分別比對照組提高2.29和2.33倍(p0.05);利用Western blot技術分析結果顯示經(jīng)低密度脂蛋白處理后,顆粒細胞中St AR蛋白表達水平較未經(jīng)處理的對照組顆粒細胞提高2.71倍(p0.05);利用油紅對兩組顆粒細胞進行染色,結果顯示經(jīng)低密度脂蛋白處理的顆粒細胞中積累的脂滴數(shù)量為124.3±24.3/細胞,明顯多于未經(jīng)處理的對照組中的脂滴數(shù)量(40.6±12/細胞;p0.01);另外,本實驗將奶牛發(fā)情中期黃體內(nèi)的黃體細胞(luteal cells,LC)分離出來并原代培養(yǎng)后,使用油紅染色并與前兩組進行對比,結果顯示黃體細胞中脂滴數(shù)量(354.1±27.9/細胞,p0.01)明顯多于顆粒細胞的對照組和低密度脂蛋白處理組;為了研究溶酶體在這個過程中的變化,我們分別使用了LAMP1免疫熒光染色和吖啶橙活體染色對兩組細胞中溶酶體形態(tài)進行分析,結果顯示LAMP1免疫熒光染色后低密度脂蛋白處理組中的LAMP1熒光強度(0.93±0.02)明顯高于對照組(0.57±0.14;p0.05),同樣地,吖啶橙(acridine orange,AO)染色也顯示低密度脂蛋白處理組中的溶酶體數(shù)量(58.2±5.5/細胞)明顯多于對照組(25.4±3.0/細胞;p0.05);另外,本實驗還對奶牛發(fā)情中期黃體中分離得到的黃體細胞在原代培養(yǎng)后,進行LAMP1免疫熒光染色和吖啶橙活體染色,并與前兩組進行對比,結果顯示黃體細胞中存在著大量的溶酶體,而其無論是LAMP1熒光強度(3.71±0.05)還是吖啶橙活體染色的溶酶體數(shù)量(301.7±5.0/細胞),均高于或多于(p0.05)對照組和低密度脂蛋白處理組的顆粒細胞。為了研究溶酶體在低密度脂蛋白誘導的顆粒細胞St AR表達和孕酮合成過程的作用,本實驗將培養(yǎng)的細胞分成三組,即對照組、低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)處理組和低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)與氯喹(chloroquine,CQ)(50μmol/L)混合處理組。孕酮檢測結果顯示,添加低密度脂蛋白和氯喹處理的顆粒細胞所產(chǎn)生的孕酮量(19.2±7.5ng/105細胞)與對照組(27±4.7ng/105細胞)無明顯差異(p0.05),但是這兩組明顯少于只添加低密度脂蛋白處理的顆粒細胞所產(chǎn)生的孕酮量(178.5±9.4ng/105細胞;p0.05);同時,Western blot結果表明當氯喹被添加到培養(yǎng)液中時,低密度脂蛋白對顆粒細胞St AR蛋白質表達的刺激作用受到了明顯抑制,即其表達水平明顯低于單獨添加低密度脂蛋白組(p0.05),而與對照組處于相似水平(p0.05)。另外,為了研究細胞內(nèi)膽固醇內(nèi)穩(wěn)態(tài)對溶酶體數(shù)量的影響,本實驗將培養(yǎng)的顆粒細胞分成兩組細胞,向其添加含有60μmol/L膽固醇(Cholesterol)的培養(yǎng)液預處理顆粒細胞1小時,然后分別更換只含有低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)以及含有低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)和膽固醇(60μmol/L)的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時。LAMP1免疫熒光分析顯示,與單獨添加低密度脂蛋白組的LAMP1的平均熒光密度(0.93±0.02)相比,添加膽固醇和低密度脂蛋白組的LAMP1平均熒光密度(0.39±0.01;p0.05)明顯減少;同樣地,吖啶橙活體染色結果顯示,膽固醇阻止了低密度脂蛋白刺激的溶酶體增多,添加膽固醇和低密度脂蛋白組顆粒細胞中的溶酶體平均數(shù)量(34.9±4.29/細胞)明顯少于單獨添加低密度脂蛋白組(75±8.25/細胞;p0.05)。因此,我們的結果表明,低密度脂蛋白通過上調牛顆粒細胞中St AR的mRNA和蛋白質表達以及P450scc的m RNA表達方式,調控其孕酮合成水平;低密度脂蛋白刺激牛顆粒細胞中產(chǎn)生大量溶酶體,并且這些溶酶體控制著低密度脂蛋白對顆粒細胞St AR蛋白質表達和孕酮合成的調控作用,而這種溶酶體數(shù)量的變化受到了顆粒細胞中膽固醇內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調節(jié)。
【學位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S823
【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 孕酮對生殖的作用與生物合成
        1.1.1 孕酮對生殖的作用
        1.1.2 孕酮的生物合成
    1.2 黃體合成孕酮的調控因素
        1.2.1 垂體激素的慢性調節(jié)
        1.2.2 LH的脈沖式釋放
        1.2.3 雌激素的影響
        1.2.4 孕酮分泌的急性調節(jié)
    1.3 StAR表達調控的研究進展
        1.3.1 StAR表達的激素調節(jié)
        1.3.2 鋅指結構轉錄因子的調節(jié)
        1.3.3 bZIP轉錄因子的調節(jié)
        1.3.4 cAMP-PKA依賴的轉錄激活
        1.3.5 StAR表達的轉錄抑制
    1.4 低密度脂蛋白的攝入與代謝
        1.4.1 低密度脂蛋白的結構
        1.4.2 低密度脂蛋白的攝入
        1.4.3 低密度脂蛋白的代謝
    1.5 溶酶體的形成
    1.6 研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實驗試劑和儀器
        2.1.1 主要試驗試劑
        2.1.2 主要試驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 牛顆粒細胞原代培養(yǎng)
        2.2.2 牛顆粒細胞的處理
        2.2.3 黃體細胞的分離與培養(yǎng)
        2.2.4 孕酮濃度測定
        2.2.5 實時熒光定量PCR
        2.2.6 蛋白印跡檢測
        2.2.7 油紅O染色
        2.2.8 吖啶橙活細胞染色
        2.2.9 免疫熒光染色
        2.2.10 統(tǒng)計分析
3 結果
    3.1 低密度脂蛋白對牛顆粒細胞孕酮合成和St AR表達的影響
    3.2 低密度脂蛋白對牛顆粒細胞中脂滴的影響
    3.3 低密度脂蛋白對牛顆粒細胞中溶酶體的影響
    3.4 溶酶體對低密度脂蛋白誘導的牛顆粒細胞St AR蛋白表達和孕酮合成的影響
    3.5 膽固醇對低密度脂蛋白誘導的牛顆粒細胞溶酶體變化的影響
4 討論
    4.1 低密度脂蛋白促進孕酮合成
    4.2 溶酶體與孕酮合成的關系
    4.3 顆粒細胞的膽固醇內(nèi)穩(wěn)態(tài)
    4.4 總結
5 結論
致謝
參考文獻
攻讀博士學位期間發(fā)表的學術論文

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本文編號：2883525