本文關(guān)鍵詞：西甜瓜轉(zhuǎn)基因抗病毒研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：西甜瓜是我國(guó)重要的葫蘆科作物,其栽培面積和消費(fèi)總量位居世界蔬菜水果前列。病毒病是葫蘆科作物生產(chǎn)中存在的重大問(wèn)題,嚴(yán)重影響著西瓜和甜瓜的產(chǎn)量與品質(zhì)。病毒病大面積爆發(fā)時(shí),導(dǎo)致產(chǎn)量降低,甚至絕產(chǎn)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段,將病毒的相關(guān)基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入西瓜和甜瓜,探討病毒與葫蘆科寄主作物之間的關(guān)系,創(chuàng)制新的抗病毒葫蘆科作物新種質(zhì),具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本研究的主要結(jié)果如下:1.優(yōu)化了西瓜的組織培養(yǎng)體系。西瓜離體繼代培養(yǎng)過(guò)程中,西瓜組培苗容易黃化,隨著繼代時(shí)間的延長(zhǎng),逐漸衰老死亡。本研究發(fā)現(xiàn),Fe鹽對(duì)黃化的影響最大,將Fe-EDTA濃度加倍,組培苗生長(zhǎng)健壯,可以持續(xù)繼代。西瓜繼代苗根數(shù)少,清洗瓊脂時(shí),容易斷根。將伸長(zhǎng)至2-3cm的西瓜小植株,切下作為接穗,嫁接到兩片子葉完全展開(kāi)的砧木上,不僅能提高成活率,而且西瓜植株生長(zhǎng)健壯,果實(shí)提早成熟一個(gè)月。解決了西瓜再生苗黃化和移栽成活率低的問(wèn)題,為西瓜轉(zhuǎn)基因技術(shù)奠定了好的基礎(chǔ)。2.建立了西瓜的遺傳轉(zhuǎn)化體系。西瓜種子在1/2 MS培養(yǎng)基上萌發(fā)4-5d,子葉顏色從黃色剛剛轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色作為外植體,切除生長(zhǎng)點(diǎn)的子葉基端接種在培養(yǎng)基MS+BA 1.0mg/L預(yù)培養(yǎng)5d,農(nóng)桿菌侵染20 min,共培養(yǎng)5d。轉(zhuǎn)基因材料通過(guò)PCR和Southern雜交檢測(cè),初步驗(yàn)證基因整合到西瓜基因組。3.人工小RNA能夠結(jié)合病毒RNA并降解其基因組,對(duì)病毒產(chǎn)生抗性。本研究利用人工小RNA技術(shù)設(shè)計(jì)的人工小RNA,可以識(shí)別黃瓜花葉病毒CMV 2a/2b基因部分編碼區(qū)對(duì)CMV病毒進(jìn)行基因表達(dá)抑制。轉(zhuǎn)化西瓜材料,接種后,轉(zhuǎn)基因株系通過(guò)ELISA檢測(cè),初步驗(yàn)證表達(dá)人工小RNA的轉(zhuǎn)基因西瓜材料對(duì)CMV病毒具有抗性。4.建立了甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系。甜瓜子葉顏色由黃色轉(zhuǎn)為綠色時(shí)作為外植體,距下胚軸1-2mm處,切下子葉基端在培養(yǎng)基MS+BA 1.2mg/L中預(yù)培養(yǎng)5d,與農(nóng)桿菌侵染20min,共培養(yǎng)3d。通過(guò)PCR和Southern雜交檢測(cè),以及GUS染色,進(jìn)一步證明甜瓜轉(zhuǎn)基因技術(shù)穩(wěn)定。5.具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植株,在植物體內(nèi)表達(dá)能夠誘導(dǎo)基因沉默,協(xié)同發(fā)揮抗病機(jī)制。本研究構(gòu)建ZYMV、WMV和CMV的3個(gè)外殼蛋白基因嵌合片段(CWZ)反向重復(fù)植物表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化常規(guī)甜瓜品種,將三種病毒的基因片段整合到甜瓜基因組,為探討轉(zhuǎn)基因葫蘆科作物通過(guò)RNA沉默實(shí)現(xiàn)抗病毒提供了新的方法。本研究為葫蘆科作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供了一些新的手段和方法,獲得了轉(zhuǎn)基因抗病毒的西瓜和甜瓜材料,具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：西瓜 甜瓜 人工小RNA 病毒 GUS RNA沉默
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S65
【目錄】：

• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 縮略詞表13-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-39
• 1.1 西甜瓜病毒病研究概況14-22
• 1.1.1 蛋白質(zhì)介導(dǎo)的病毒抗性16-17
• 1.1.2 RNA介導(dǎo)的病毒抗性17-21
• 1.1.3 非病毒來(lái)源的抗性21-22
• 1.1.4 抗病毒基因工程存在的問(wèn)題22
• 1.2 西瓜抗病毒基因工程研究進(jìn)展22-32
• 1.2.1 西瓜組織培養(yǎng)研究進(jìn)展23-27
• 1.2.1.1 種子貯存時(shí)間影響叢生芽再生24
• 1.2.1.2 基因型和苗齡的影響24
• 1.2.1.3 外植體類(lèi)型的影響24-25
• 1.2.1.4 激素組合對(duì)西瓜分化的影響25-26
• 1.2.1.5 培養(yǎng)條件的影響26
• 1.2.1.6 西瓜組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的問(wèn)題26-27
• 1.2.2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在西瓜育種上的應(yīng)用27-32
• 1.2.2.1 篩選標(biāo)記基因?qū)D(zhuǎn)化的影響28-29
• 1.2.2.2 不同的農(nóng)桿菌菌株對(duì)轉(zhuǎn)化的影響29
• 1.2.2.3 預(yù)培養(yǎng)對(duì)轉(zhuǎn)化的影響29-30
• 1.2.2.4 侵染時(shí)間和濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響30
• 1.2.2.5 共培養(yǎng)對(duì)轉(zhuǎn)化的影響30
• 1.2.2.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)西瓜遺傳轉(zhuǎn)化的主要問(wèn)題30-32
• 1.3 甜瓜抗病毒基因工程研究進(jìn)展32-38
• 1.3.1 甜瓜組織培養(yǎng)體系研究進(jìn)展33-35
• 1.3.1.1 基因型33
• 1.3.1.2 外植體33-34
• 1.3.1.3 子葉苗齡34
• 1.3.1.4 植物激素34
• 1.3.1.5 培養(yǎng)條件34-35
• 1.3.2 甜瓜轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展35-38
• 1.4 轉(zhuǎn)基因?qū)ξ魈鸸峡共⌒缘母牧己驼雇?/span>38-39
• 第二章 西瓜轉(zhuǎn)基因抗病毒研究39-70
• 2.1 前言39-40
• 2.2 材料和方法40-47
• 2.2.1 植物和病毒材料40
• 2.2.2 菌株和質(zhì)粒40
• 2.2.3 人工mi RN A植物表達(dá)載體構(gòu)建40
• 2.2.4 西瓜再生40-42
• 2.2.4.1 外植體的獲得40-41
• 2.2.4.2 苗齡對(duì)誘導(dǎo)叢生芽的影響41
• 2.2.4.3 不同部位外植體誘導(dǎo)叢生芽的影響41
• 2.2.4.4 激素水平對(duì)叢生芽再生率的影響41
• 2.2.4.5 液體和固體培養(yǎng)基對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響41
• 2.2.4.6 KH_2PO_4水平對(duì)誘導(dǎo)叢生芽的影響41-42
• 2.2.4.7 Fe-EDTA水平對(duì)再生芽黃化的影響42
• 2.2.5 西瓜遺傳轉(zhuǎn)化42-47
• 2.2.5.1 Kan抗性的影響42-43
• 2.2.5.2 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間43
• 2.2.5.3 侵染時(shí)間43
• 2.2.5.4 共培養(yǎng)時(shí)間43
• 2.2.5.5 轉(zhuǎn)基因西瓜植株DNA提取43-44
• 2.2.5.6 轉(zhuǎn)基因西瓜植株P(guān)CR陽(yáng)性檢測(cè)44
• 2.2.5.7 Southern雜交44-46
• 2.2.5.8 病毒接種攻毒試驗(yàn)46
• 2.2.5.9 ELISA檢測(cè)CMV病毒積累情況46-47
• 2.3 結(jié)果與分析47-62
• 2.3.1 培養(yǎng)基對(duì)西瓜種子萌發(fā)的影響47-48
• 2.3.2 不同苗齡誘導(dǎo)叢生芽的影響48-49
• 2.3.3 子葉塊部位對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響49-50
• 2.3.4 激素組合對(duì)外植體叢生芽的影響50-51
• 2.3.5 固體和液體培養(yǎng)基對(duì)再生芽的影響51-52
• 2.3.6 KH_2PO_4水平對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響52-53
• 2.3.7 Fe-EDTA水平對(duì)子葉黃化的影響53-55
• 2.3.8 Kan敏感性測(cè)定55-57
• 2.3.8.1 Kan處理子葉塊濃度篩選55-56
• 2.3.8.2 Kan處理種子濃度篩選56-57
• 2.3.9 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化叢生芽誘導(dǎo)的影響57-58
• 2.3.10 侵染時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化叢生芽誘導(dǎo)的影響58
• 2.3.11 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化叢生芽誘導(dǎo)的影響58-59
• 2.3.12 轉(zhuǎn)基因西瓜植株嫁接成活情況59-60
• 2.3.13 轉(zhuǎn)基因西瓜植株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果60
• 2.3.14 轉(zhuǎn)基因西瓜植株Southern blot檢測(cè)結(jié)果60-61
• 2.3.15 轉(zhuǎn)基因西瓜植株抗病毒試驗(yàn)61-62
• 2.4 討論62-68
• 2.4.1 基本培養(yǎng)基對(duì)西瓜種子萌發(fā)的影響62-63
• 2.4.2 苗齡對(duì)西瓜再生的影響63
• 2.4.3 外植體部位對(duì)西瓜再生的影響63-64
• 2.4.4 KH2PO4對(duì)西瓜叢生芽誘導(dǎo)的影響64
• 2.4.5 Fe-EDTA對(duì)叢生芽黃化的影響64-65
• 2.4.6 不同激素組合對(duì)西瓜再生的影響65-66
• 2.4.7 抗生素濃度篩選66
• 2.4.8 預(yù)培養(yǎng)對(duì)抗性芽分化的影響66-67
• 2.4.9 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抗性芽分化的影響67
• 2.4.10 轉(zhuǎn)基因西瓜抗病毒的穩(wěn)定性67-68
• 2.5 小結(jié)68-70
• 第三章 甜瓜轉(zhuǎn)基因抗病毒研究70-92
• 3.1 前言70-71
• 3.2. 材料和方法71-76
• 3.2.1 植物和病毒材料71
• 3.2.2 菌株和質(zhì)粒71
• 3.2.3 CWZ RNAi植物表達(dá)載體構(gòu)建71-72
• 3.2.4 甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化72-74
• 3.2.4.1 激素濃度對(duì)甜瓜外植體誘導(dǎo)叢生芽再生的影響73
• 3.2.4.2 甜瓜不同外植體誘導(dǎo)叢生芽73-74
• 3.2.4.3 甜瓜子葉和種子對(duì)Kan的敏感性試驗(yàn)74
• 3.2.4.4 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的影響74
• 3.2.4.5 侵染時(shí)間的影響74
• 3.2.4.6 共培養(yǎng)時(shí)間的影響74
• 3.2.5 轉(zhuǎn)基因甜瓜植株DNA提取74-75
• 3.2.6 轉(zhuǎn)基因甜瓜植株的PCR檢測(cè)75
• 3.2.7 Southern雜交75
• 3.2.8 GUS染色75-76
• 3.3 結(jié)果與分析76-85
• 3.3.1 激素濃度對(duì)甜瓜子葉誘導(dǎo)叢生芽的影響76-77
• 3.3.2 激素濃度對(duì)甜瓜葉片誘導(dǎo)叢生芽的影響77-78
• 3.3.3 不同甜瓜子葉部位的影響78-79
• 3.3.4 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的研究79-80
• 3.3.5 侵染時(shí)間的影響80-81
• 3.3.6 共培養(yǎng)時(shí)間的影響81
• 3.3.7 甜瓜對(duì)kan的敏感性試驗(yàn)81-83
• 3.3.8 轉(zhuǎn)基因T0代甜瓜葉片GUS測(cè)定83-84
• 3.3.9 PCR檢測(cè)CWZ嵌合基因整合情況84-85
• 3.3.10 Southern進(jìn)一步檢測(cè)CWZ基因整合結(jié)果85
• 3.4 討論85-89
• 3.5 小結(jié)89-92
• 參考文獻(xiàn)92-102
• 個(gè)人簡(jiǎn)介102-103
• 致謝103-105

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

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3 黃學(xué)森，焦定量，那麗;西瓜子葉離體培養(yǎng)獲得再生植株[J];中國(guó)西瓜甜瓜;1994年03期

  本文關(guān)鍵詞：西甜瓜轉(zhuǎn)基因抗病毒研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：286274