發(fā)布時(shí)間：2020-10-23 18:25

　　 豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病毒性傳染病之一。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類法定報(bào)告動(dòng)物疫病,我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。該病的病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV),動(dòng)脈炎病毒科成員。PRRSV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒,具有廣泛的基因多樣性和高度的變異性。PRRSV感染后抑制機(jī)體的先天性免疫應(yīng)答,并且誘導(dǎo)中和抗體的水平低,給該病的防控帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。目前PRRS預(yù)防主要依靠弱毒疫苗的免疫接種,但在現(xiàn)地,由于種種原因,免疫失敗時(shí)有發(fā)生,因而開發(fā)新的PRRS防治策略很有必要。本研究以PRRSV弱毒苗(CH-1R)感染性克隆為載體,首先構(gòu)建不同Body TRS啟動(dòng)表達(dá)EGFP的重組病毒,以此為模型比較不同Body TRS表達(dá)外源基因的效率;在此基礎(chǔ)上構(gòu)建Body TRS6啟動(dòng)表達(dá)豬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(pGM-CSF)或/和豬白細(xì)胞介素-4(pIL-4)的重組PRRSV;在豬體內(nèi)進(jìn)行免疫保護(hù)攻毒實(shí)驗(yàn),比較重組病毒與親本毒株的免疫效率。取得的成果如下:1構(gòu)建在PRRSV基因組N基因和3’-UTR之間由不同Body TRS啟動(dòng)表達(dá)EGFP的重組感染性克隆,轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞后,可以拯救出病毒。病毒生物學(xué)特性分析表明,重組病毒的生長(zhǎng)特性與親本毒株相似。初步比較不同Body TRS啟動(dòng)表達(dá)EGFP的效率表明,Body TRS6的效率最高,其次為Body TRS2/5/7,Body TRS3/4啟動(dòng)表達(dá)EGFP的效率最低。遺傳穩(wěn)定性結(jié)果顯示,重組病毒至少可以在Marc-145細(xì)胞上穩(wěn)定傳至5代以上。2構(gòu)建在PRRSV基因組N基因和3’-UTR之間插入由Body TRS6啟動(dòng)表達(dá)pGM-CSF或/和pIL-4的重組感染性克隆,轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞后,可以拯救出病毒。病毒生物學(xué)特性分析表明,重組病毒的生長(zhǎng)特性與親本毒株相似。遺傳穩(wěn)定性分析表明,單獨(dú)表達(dá)pGM-CSF的重組病毒在Marc-145細(xì)胞上至少可以穩(wěn)定傳至10代以上,并且具有良好的刺激骨髓細(xì)胞增殖的能力。單獨(dú)表達(dá)pIL-4的重組病毒至少可以穩(wěn)定傳至15代以上,而同時(shí)表達(dá)這兩種細(xì)胞因子的重組病毒在傳至第3代或者第5代時(shí),目的基因已經(jīng)逐漸丟失。3運(yùn)用免疫保護(hù)攻毒實(shí)驗(yàn)研究重組病毒CH-1R/pGM-CSF的免疫效率,結(jié)果顯示CH-1R/pGM-CSF誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生了與CH-1R相似的體液免疫水平。細(xì)胞免疫方面,與CH-1R相比,CH-1R/pGM-CSF在攻毒當(dāng)天以及攻毒后第7天,在外周血中誘導(dǎo)出更高比例的CD4+CD8+T細(xì)胞以及高水平的IFN-γ,攻毒后21天的病毒血癥也明顯降低,同時(shí)體溫升高的幅度也低于CH-1R。以上結(jié)果表明,CH-1R/pGM-CSF可以誘導(dǎo)出比CH-1R更高的細(xì)胞免疫水平,同時(shí)可以降低HP-PRRSV在豬體內(nèi)的持續(xù)性感染。4運(yùn)用免疫保護(hù)攻毒實(shí)驗(yàn)研究重組病毒CH-1R/pIL-4的免疫效率,結(jié)果顯示重組病毒具有與親本毒株CH-1R相似的誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的能力。細(xì)胞免疫方面,與CH-1R相比,CH-1R/pIL-4免疫組在攻毒后第3天和第7天在外周血中誘導(dǎo)出更高比例的CD4+CD8+T細(xì)胞,同時(shí)CH-1R/pIL-4免疫組在攻毒后第7天血清中IL-4的水平顯著高于CH-1R免疫組,但攻毒后這2個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間病毒血癥,體溫變化以及臨床表現(xiàn)都沒有顯著差異。以上結(jié)果表明,CH-1R/pIL-4沒有顯著提高疫苗的保護(hù)效率。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

.1 吸附和進(jìn)入PRRSV 在較低 PH 值條件下進(jìn)入細(xì)胞，整個(gè)過程是通過標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)吞方auwynck et al. 1999)。敲除網(wǎng)格蛋白（Clathrin）的重鏈抑制了 EAV 的感染，示動(dòng)脈炎病毒顆粒都包含有一個(gè)被網(wǎng)格蛋白包裹的相對(duì)較小的結(jié)構(gòu)(Nits08; Snijder et al. 1998)

leader TRS hairpin”(LTH)在轉(zhuǎn)錄中也發(fā)揮著重要角色(van den Born et al. 2004)。PRNA 合成示意圖見 1-2。

不同BodyTRS啟動(dòng)EGFP表達(dá)的重組PRRSV感染性克隆結(jié)構(gòu)示意圖
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3 鈔安軍;郭曉慶;顧陽(yáng);朱前磊;付朋飛;崔保安;陳紅英;;PCV2 ORF2蛋白重組PRV病毒PGO株的生物學(xué)特性[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年06期

4 曹永長(zhǎng),畢英佐,劉麗;一種獲得重組傳染性法氏囊病病毒的新方法[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2002年01期

5 于曼,秦鄂德,陳水平,趙月峨,范寶昌,段鴻元,姜濤,楊佩英,胡志君;登革2型PrM基因的重組病毒對(duì)不同型別登革病毒復(fù)制的阻斷作用[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2002年05期

6 井波;李呈軍;陳化蘭;;利用反向遺傳技術(shù)拯救H9N2重組病毒[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2011年06期

7 顏艷;楊鵬輝;羅德炎;崔萍;王希良;何維明;;用反向遺傳8質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu)建流感H1N1重組病毒[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2007年09期

8 周潔文;滕巧泱;閆麗萍;邊延峰;張旭;徐大偉;石迎;周雨霞;李澤君;;高增殖性能犬流感CIV-PR8重組病毒的制備[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2012年07期

9 鄧小昭,何亮,刁振宇,張林元,李光富;重組病毒/家蠶細(xì)胞系統(tǒng)穩(wěn)定高效表達(dá)HBeAg基因的研究[J];藥物生物技術(shù);1998年02期

10 方肇寅,O.Kew,任斌,鄭渡平,溫樂英,楊辰夫,蘇錦,陳美光,鄭煥英,孟憲坤,張振國(guó),劉復(fù)林,H.Yoshikura;在我國(guó)流行的脊髓灰質(zhì)炎中發(fā)現(xiàn)脊灰病毒Ⅰ型自然重組株[J];病毒學(xué)報(bào);1993年03期

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2 焦洋;HIV-1耐藥相關(guān)特征性突變位點(diǎn)及復(fù)制適應(yīng)性研究[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2015年

3 李治軍;表達(dá)豬源GM-CSF或IL-4的重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒的構(gòu)建及其免疫效率評(píng)價(jià)[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

4 孫學(xué)強(qiáng);馬皰疹病毒1型感染性克隆及表達(dá)豬鏈球菌2型亞單位重組病毒的構(gòu)建[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

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6 邱薇;犬2型腺病毒基因重組活疫苗的基礎(chǔ)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍需大學(xué);2001年

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9 賈雷立;核酸探針與PCR方法對(duì)重組病毒vFV282株的鑒定研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

10 楊用光;表達(dá)IBDV-VP2蛋白的重組禽Ⅰ型腺病毒（rFAv-VP2）的構(gòu)建及純化[D];揚(yáng)州大學(xué);2006年

本文編號(hào)：2853385