RNAi是由dsRNA引發(fā)的,靶向切割mRNA的高效特異的基因沉默技術(shù)。由于該技術(shù)具有高效性和便捷性,因此RNAi技術(shù)在包括基因功能研究、高通量靶標(biāo)基因篩選、基因治療、藥物靶標(biāo)預(yù)測(cè)和農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害防治等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。RNAi實(shí)現(xiàn)方式包括顯微注射、浸泡和飼喂法。雖然RNAi是一種廣泛存在于多種真核生物并高度保守的機(jī)制,但是RNAi的應(yīng)用仍然面對(duì)很多問(wèn)題,例如包括許多雙翅目昆蟲(chóng)在內(nèi)的部分物種中RNAi難以實(shí)現(xiàn)和RNAi效應(yīng)持續(xù)時(shí)間較短等。橘小實(shí)蠅的RNAi研究目前尚屬空白。橘小實(shí)蠅是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng),為害250多種蔬果。本研究以橘小實(shí)蠅為研究對(duì)象,建立橘小實(shí)蠅的飼喂法RNAi體系；利用RNAi技術(shù)研究橘小實(shí)蠅spr基因和共生病毒功能；首次發(fā)現(xiàn)了橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi的免疫耐受現(xiàn)象并闡述其機(jī)制。1.成功建立了橘小實(shí)蠅飼喂法RNAi體系。直接喂食靶標(biāo)基因dsRNA和喂食表達(dá)靶標(biāo)基因dsRNA的大腸桿菌均可以實(shí)現(xiàn)目的基因沉默。其中rpll9 dsRNA喂食組橘小實(shí)蠅rpll9基因表達(dá)量在喂食后第1天和第7天分別出現(xiàn)了89%和85%的下調(diào)。在表達(dá)rpll9 dsRNA大腸桿菌喂食組中,rpll9基因表達(dá)水平于第1天和第7天出現(xiàn)了30%的下調(diào)。在V-ATP-D dsRN A喂食組中,V-ATP-D基因表達(dá)水平在第4天出現(xiàn)了幅度為36%下調(diào)。在表達(dá)V-ATP-D dsRNA的大腸桿菌喂食組中,V-ATP-D基因表達(dá)水平在第4天出現(xiàn)了50%的下調(diào)。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)基因在飼喂dsRNA和表達(dá)dsRNA的菌液后于第2天或第4天出現(xiàn)了上調(diào)dsRNA喂食組橘小實(shí)蠅rpll9基因表達(dá)量在喂食后第4天出現(xiàn)了3倍的上調(diào)。在表達(dá)V-ATP-D dsRNA的大腸桿菌喂食組中,V-ATP-D基因表達(dá)水平在第2天出現(xiàn)了1.6倍的上調(diào)。組織特異性檢測(cè)結(jié)果表明飼喂法RNAi所引起的RNAi不局限于中腸,可以在頭、生殖系統(tǒng)和脂肪體中觀察到。其中,dsRNA喂食RNAi導(dǎo)致noa基因表達(dá)水平于生測(cè)后第2天在頭、卵巢、精巢和脂肪體中分別出現(xiàn)了64%、23%、95%和89%的下調(diào)。連續(xù)喂食rpl19 dsRNA 12天后,rpll9基因表達(dá)水平恢復(fù)到正常,與egfp dsRNA喂食組無(wú)顯著差異。同時(shí),使用500ng/μl、100ng/μl和10 ng/μl rpl19 dsRNA進(jìn)行橘小實(shí)蠅喂食RNAi實(shí)驗(yàn)均觀察到rpll9基因表達(dá)水平于12天后恢復(fù)至正常水平。使用羽化后5天和羽化后10天橘小實(shí)蠅進(jìn)行的rpl19 dsRNA喂食實(shí)驗(yàn)也觀察到這一現(xiàn)象。上述結(jié)果表明這一現(xiàn)象與生測(cè)所用橘小實(shí)蠅的蟲(chóng)齡以及生測(cè)使用的dsRNA濃度無(wú)關(guān)。對(duì)F2代成蟲(chóng)RNAi效應(yīng)檢測(cè)結(jié)果表明親代的RNAi干擾對(duì)子代沒(méi)有影響。對(duì)子代初羽化成蟲(chóng)進(jìn)行的rpll9 dsRNA喂食實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rpll9基因表達(dá)水平下調(diào)了66%,與親代未經(jīng)RNAi處理的F2代成蟲(chóng)喂食RNAi結(jié)果一致。2.我們首次發(fā)現(xiàn)橘小實(shí)蠅可以對(duì)RNAi產(chǎn)生免疫耐受并闡述了其機(jī)制。第一次喂食rpl19 dsRNA的RNAi導(dǎo)致rpll9基因下調(diào)66%；在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的第二次喂食rpll9 dsRNA的RNAi無(wú)法引起rpll9基因下調(diào)。結(jié)果表明第一次針對(duì)內(nèi)源基因的RNAi可以使橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi產(chǎn)生免疫耐受現(xiàn)象。同時(shí)這種免疫耐受現(xiàn)象是非基因特異的。第一次喂食rpl19 dsRNA的RNAi同樣使橘小實(shí)蠅對(duì)第二次喂食spr dsRNA的RNAi產(chǎn)生免疫,spr表達(dá)水平在第二次RNAi中不出現(xiàn)下調(diào)。1000ng/μl rpl19 dsRNA引起的橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi的免疫耐受性持續(xù)20-30天；100 ng/μl和10 ng/μl rpl19 dsRNA引起的橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi的免疫耐受性分別持續(xù)10-20天和5天,表明橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi的免疫耐受性的持續(xù)時(shí)間和第一次RNAi中所使用的dsRNA濃度相關(guān)。通過(guò)巴弗洛霉素處理橘小實(shí)蠅腸道,我們發(fā)現(xiàn)橘小實(shí)蠅的dsRNA攝取是由胞吞機(jī)制調(diào)控的。熒光免疫染色研究結(jié)果表明在對(duì)RNAi免疫耐受的橘小實(shí)蠅中,dsRNA攝取機(jī)制受到了阻遏,dsRNA無(wú)法正常進(jìn)入細(xì)胞。在對(duì)RNAi免疫耐受的橘小實(shí)蠅中,che、light、cog3、ap50和nina c等基因均出現(xiàn)了30%-60%的下調(diào),表明其對(duì)RNAi的免疫耐受性是由胞吞機(jī)制的活性下降所引起的。這一結(jié)論也得到了高通量測(cè)序結(jié)果的支持。高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞運(yùn)輸?shù)腸hc、actinl、actin2和actin5等基因出現(xiàn)下調(diào)。而通過(guò)利用雙氧水促進(jìn)肌動(dòng)蛋白形成可以解除橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi的免疫耐受。5%的H202與100 ng/μl rpl19 dsRNA共喂食引起對(duì)RNAi免疫耐受的橘小實(shí)蠅中rpll9基因表達(dá)水平出現(xiàn)50%的下調(diào)。這些研究結(jié)果證實(shí)了胞吞機(jī)制受阻是橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi產(chǎn)生免疫耐受現(xiàn)象的關(guān)鍵原因。3.通過(guò)上述建立的RNAi技術(shù)發(fā)現(xiàn)spr參與了橘小實(shí)蠅交配后抗氧化脅迫能力的改變。通過(guò)克隆獲取橘小實(shí)蠅spr基因全長(zhǎng),該基因編碼324個(gè)氨基酸。cDNA序列十分保守,與地中海實(shí)蠅spr相似度為86%(E值=0)。spr表達(dá)模式結(jié)果顯示spr在中腸中表達(dá)量最高,其次為后腸和頭部。spr在不同發(fā)育階段的橘小實(shí)蠅中均有表達(dá),其中在幼蟲(chóng)和蛹期表達(dá)水平最高。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)橘小實(shí)蠅交配后雌蟲(chóng)的抗氧化脅迫能力下降。在雙氧水生測(cè)中,交配后的雌蟲(chóng)存活率明顯低于未交配雌蟲(chóng),生測(cè)開(kāi)始后72小時(shí)的交配組雌蟲(chóng)存活率為9.4%,在同一時(shí)間點(diǎn),未交配雌蟲(chóng)存活率為56.7%(p=0.017)。同時(shí)交配后TOR信號(hào)通路的rheb基因上調(diào)了88%、tor基因上調(diào)了28%。此外,TOR通路的關(guān)鍵效應(yīng)基因s6k上調(diào)了54%,表明橘小買蠅對(duì)氧化脅迫敏感性上升；而通過(guò)顯微注射spr dsRNA,成功敲除spr,使spr基因表達(dá)水平下調(diào)了75%后,橘小實(shí)蠅交配后抗氧化脅迫能力不變,TOR通路基因的表達(dá)水平也未發(fā)生變化。這些結(jié)果表明spr通過(guò)TOR通路參與了橘小實(shí)蠅交配后抗氧化脅迫能力的改變。4.利用RNAi技術(shù)研究橘小實(shí)蠅共生病毒的功能。根據(jù)DGE和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果,我們鑒定了8個(gè)橘小實(shí)蠅共生病毒序列。其中contig1697、contig475、comp2791和comp11365編碼雙順?lè)醋硬《究撇《镜慕Y(jié)構(gòu)蛋白或者非結(jié)構(gòu)蛋白。comp3227和comp 16524編碼RdRp聚合酶,屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)。我們利用comp 11365病毒RdRp序列確認(rèn)其分類地位為小RNA病毒目(Picomavirales)、雙順?lè)醋硬《究?Dicistroviridae)、蟋蟀麻痹病毒屬(Cripavirus),并將其命名為Bdv-1。Bdv-1病毒主要分布于橘小實(shí)蠅中腸,其含量為生殖系統(tǒng)的3000倍。使用飼喂法干擾Bdv-1表達(dá)后,我們檢測(cè)到橘小實(shí)蠅中腸中Bdv-1含量下調(diào)了48%。飼喂法干擾Bdv-1后,我們發(fā)現(xiàn)橘小實(shí)蠅中腸總菌群下降了54%左右。γ變形菌、擬桿菌和放線菌與egfp dsRNA對(duì)照組相比均出現(xiàn)了約50%的下調(diào)。α變形菌與厚壁菌在飼喂法干擾Bdv-1后與egfp dsRNA對(duì)照組無(wú)顯著性差異。這些結(jié)果證明Bdv-1與腸道菌群數(shù)量相關(guān)。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S433
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1 RNAi的發(fā)現(xiàn)
    2 RNAi的分類和機(jī)制
        2.1 細(xì)胞自主型RNAi
        2.2 非細(xì)胞自主型RNAi
    3 RNAi機(jī)制的生理功能
    4 RNAi的應(yīng)用現(xiàn)狀及進(jìn)展
    5 RNAi在昆蟲(chóng)中的應(yīng)用
        5.1 RNAi在昆蟲(chóng)基因功能研究中的作用
        5.2 RNAi在害蟲(chóng)防治中的應(yīng)用
            5.2.1 顯微注射法RNAi在害蟲(chóng)防治中的應(yīng)用
            5.2.2 飼喂法RNAi在害蟲(chóng)防治中的應(yīng)用
            5.2.3 轉(zhuǎn)基因作物RNAi在害蟲(chóng)防治中的應(yīng)用
            5.2.4 滴注法RNAi在害蟲(chóng)防治中的應(yīng)用
    6 目的及意義
第二章 橘小實(shí)蠅飼喂法RNAi體系建立
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 供試?yán)ハx(chóng)
            1.1.2 主要儀器設(shè)備
            1.1.3 常用緩沖液、培養(yǎng)基及抗生素的配制
            1.1.4 菌株和質(zhì)粒
            1.1.5 主要試劑及試劑盒
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 橘小實(shí)蠅總RNA提取
            1.2.2 簡(jiǎn)并引物和特異性引物設(shè)計(jì)
            1.2.3 rpl19和V-ATP-D基因克隆
            1.2.4 rpl19和V-ATP-D dsRNA表達(dá)和提取
            1.2.5 生測(cè)方法
            1.2.6 熒光定量PCR
            1.2.7 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 rpl19和V-ATP-D序列克隆及分析
            2.1.1 橘小實(shí)蠅總RNA提取
            2.1.2 目標(biāo)基因擴(kuò)增結(jié)果
            2.1.3 rpl19和V-ATP-D序列分析
        2.2 dsRNA表達(dá)載體構(gòu)建及dsRNA提取
        2.3 菌液喂食可行性檢測(cè)和dsRNA穩(wěn)定性檢測(cè)
        2.4 內(nèi)參基因篩選以及熒光定量擴(kuò)增效率確認(rèn)
        2.5 dsRNA飼喂法和菌液飼喂法均可以下調(diào)靶標(biāo)基因表達(dá)水平
        2.6 RNAi效應(yīng)組織特異性分析
        2.7 長(zhǎng)期喂食RNAi效應(yīng)檢測(cè)
        2.8 F2代橘小實(shí)蠅RNAi效應(yīng)檢測(cè)
        2.9 不同濃度rpl19 dsRNA喂食RNAi效應(yīng)檢測(cè)
        2.10 不同蟲(chóng)齡橘小實(shí)蠅成蟲(chóng)喂食RNAi效應(yīng)檢測(cè)
    3 討論
第三章 基于RNAi技術(shù)的spr基因功能研究
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 供試?yán)ハx(chóng)
            1.1.2 主要儀器設(shè)備
            1.1.3 主要試劑及試劑盒
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 總RNA提取
            1.2.2 spr基因全長(zhǎng)克隆及序列分析
            1.2.3 熒光定量PCR
            1.2.4 生測(cè)方法
            1.2.5 RNAi研究spr功能
            1.2.6 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果及分析
        2.1 spr基因克隆及序列分析
        2.2 橘小實(shí)蠅spr表達(dá)譜分析
        2.3 橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)交配后TOR信號(hào)通路上調(diào)
        2.4 交配降低橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)抗氧化脅迫能力
        2.5 spr調(diào)控交配后雌蟲(chóng)抗氧化脅迫能力變化
    3 討論
第四章 基于RNAi技術(shù)的橘小實(shí)蠅共生病毒功能研究
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 供試?yán)ハx(chóng)
            1.1.2 主要儀器設(shè)備
            1.1.3 主要試劑及試劑盒
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 總RNA提取
            1.2.2 總DNA提取
            1.2.3 病毒序列注釋
            1.2.4 Bdv-1 RNAi
            1.2.5 腸道細(xì)菌熒光定量PCR計(jì)數(shù)和菌落計(jì)數(shù)
            1.2.6 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)8條病毒序列
        2.2 病毒片段的表達(dá)譜
        2.3 Bdv-1與橘小實(shí)蠅腸道微生物穩(wěn)態(tài)有關(guān)
    3 討論
第五章 橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi的免疫耐受及其機(jī)理研究
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 供試?yán)ハx(chóng)
            1.1.2 主要儀器設(shè)備
            1.1.3 主要試劑
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 dsRNA制備
            1.2.2 喂食生測(cè)方法
2O₂解除橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi的免疫耐受實(shí)驗(yàn)'>            1.2.3 H₂O₂解除橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi的免疫耐受實(shí)驗(yàn)
            1.2.4 數(shù)字基因表達(dá)譜
            1.2.5 顯微注射
            1.2.6 cy3熒光標(biāo)記dsRNA
            1.2.7 組織培養(yǎng)
            1.2.8 免疫熒光染色
            1.2.9 熒光定量PCR
            1.2.10 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果及分析
        2.1 喂食非靶標(biāo)基因dsRNA的RNAi效應(yīng)
        2.2 喂食靶標(biāo)基因dsRNA引起橘小實(shí)蠅RNAi免疫耐受
        2.3 RNAi免疫耐受不具備基因特異性
        2.4 不同濃度靶標(biāo)基因dsRNA的免疫耐受效果
        2.5 胞吞機(jī)制受阻導(dǎo)致橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi免疫耐受
        2.6 免疫耐受橘小實(shí)蠅差異表達(dá)基因
        2.7 雙氧水促進(jìn)胞吞機(jī)制從而打破免疫耐受
    3 討論
第六章 結(jié)論與展望
    1 結(jié)論
    2 創(chuàng)新點(diǎn)
    3 展望
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文
致謝

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4 記者 溫海龍;十四國(guó)專家來(lái)榕“取經(jīng)”[N];福州日?qǐng)?bào);2009年

5 梁煒;山東鴨梨輸美不再需要冷處理[N];中國(guó)國(guó)門時(shí)報(bào);2008年

6 徐瑛;王立紅;歸來(lái)勿帶洋水果[N];中國(guó)國(guó)門時(shí)報(bào);2003年

7 憲臣邋通訊員 玉林 全意;煙臺(tái)鴨梨重獲競(jìng)爭(zhēng)力[N];煙臺(tái)日?qǐng)?bào);2008年

8 本報(bào)記者 雷光美 通訊員 郭勝鑫 楊志慧 楊特團(tuán);綠色防控,現(xiàn)代農(nóng)業(yè)制勝法寶[N];福建日?qǐng)?bào);2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 胡建峰;橘小實(shí)蠅監(jiān)測(cè)、生物防治及蛋白鉺劑應(yīng)用機(jī)理[D];福建農(nóng)林大學(xué);2012年

2 李曉雪;橘小實(shí)蠅RNAi及其對(duì)RNAi的免疫耐受機(jī)制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 王洪秀;橘小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalis）成蟲(chóng)腸道細(xì)菌分子多態(tài)性分析及其功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

4 耿軍靈;阿里山潛蠅繭蜂大量飼養(yǎng)及對(duì)橘小實(shí)蠅的控制研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王旭;湖北武漢橘小實(shí)蠅的發(fā)生動(dòng)態(tài)及入侵來(lái)源[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 林志強(qiáng);重慶市沙坪壩區(qū)橘小實(shí)蠅種群發(fā)生規(guī)律研究[D];西南大學(xué);2015年

3 鄒聰;inaC基因在橘小實(shí)蠅光響應(yīng)中的功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 王愛(ài)琳;PGRP-LB和PGRP-SB基因在橘小實(shí)蠅免疫及腸道微生物調(diào)控中的作用研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 柳靜;橘小實(shí)蠅精子發(fā)生相關(guān)基因功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 胡黎華;寄主轉(zhuǎn)換對(duì)橘小實(shí)蠅種群動(dòng)態(tài)和抗氧化酶系的影響[D];西南大學(xué);2011年

7 楊春花;影響橘小實(shí)蠅蛹色伴性遺傳品系質(zhì)量的因素[D];福建農(nóng)林大學(xué);2011年

8 高強(qiáng);橘小實(shí)蠅人工飼料的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

9 高揚(yáng);橘小實(shí)蠅飼養(yǎng)方法的改進(jìn)及田間防治[D];福建農(nóng)林大學(xué);2012年

10 楊莉莉;水解蛋白對(duì)橘小實(shí)蠅生理機(jī)制影響的研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2832747