【摘要】：在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在兩種冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(CIRP和RBM3)。當(dāng)細(xì)胞暴露于適度的冷應(yīng)激及其他應(yīng)激條件如:紫外線輻射、缺氧之后,這兩種蛋白就會(huì)隨之被誘導(dǎo)產(chǎn)生。起初學(xué)者們認(rèn)為這些蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞增殖有抑制而非刺激作用;然而,近期學(xué)者證實(shí)CIRP具有增殖和/或原致癌基因的功能。有報(bào)道提出CIRP在小鼠原代細(xì)胞中是屬于永生化基因,另外其轉(zhuǎn)化作用也已經(jīng)被證明,而且人類患腫瘤時(shí),CIRP和RBM3這兩個(gè)因子表達(dá)均發(fā)生上調(diào)。有學(xué)者推測(cè)CIRP可能通過抵消氧化損傷,進(jìn)而參與并介導(dǎo)其他凋亡通路。相比于細(xì)菌和植物,目前對(duì)于哺乳動(dòng)物冷休克反應(yīng)的研究較少,但在某些領(lǐng)域例外,如適應(yīng)性產(chǎn)熱作用、耐寒性、細(xì)胞和器官的貯存等。另外,在腦損傷治療和蛋白質(zhì)合成領(lǐng)域,對(duì)冷應(yīng)激反應(yīng)的研究也相對(duì)較多。在細(xì)胞水平,一些哺乳動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)與微生物是相似的;冷應(yīng)激改變細(xì)胞膜的脂質(zhì)組成,并抑制蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞增殖的速率。雖然目前的研究主要涉及溫度20℃以下的冷應(yīng)激,但是輕度低溫(25℃)就可以改變隨后的細(xì)胞應(yīng)答,HSP110家族的成員APG-1有明顯的表現(xiàn)。此外,25℃應(yīng)激就能誘導(dǎo)CIRP(冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白)的表達(dá),CIRP是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)被鑒定出的第一個(gè)冷休克蛋白質(zhì)。與HSP相同的是,CIRP在37℃也表達(dá)并且可能擔(dān)任一種RNA分子伴侶。哺乳動(dòng)物細(xì)胞在25℃具有代謝活性,細(xì)胞可以存活,并且可以對(duì)應(yīng)激刺激產(chǎn)生應(yīng)答,因此,亞低溫下哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)研究,將可能會(huì)對(duì)醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域產(chǎn)生影響。(1)冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein,CIRP)調(diào)控動(dòng)物機(jī)體對(duì)低溫的產(chǎn)生相對(duì)適應(yīng)性。CIRP基因在多種組織中都有表達(dá);特別是低溫、低氧及強(qiáng)紫外線輻射等條件都能誘導(dǎo)其表達(dá)。本研究選取海拔3000-5000 m的青海成年牦牛(Bos grunniens)為研究對(duì)象,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot技術(shù)及免疫組化技術(shù),提取牦牛大腦組織cDNA克隆CIRP開放閱讀框(ORF),并分析CIRP的mRNA和蛋白在牦牛大腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢、睪丸及皮膚中的表達(dá)與分布水平。結(jié)果顯示,CIRP mRNA序列編碼區(qū)長(zhǎng)為642bp,編碼213個(gè)氨基酸,編碼蛋白大小約為23kD,與家牛有較高的同源性。cirp在心臟、大腦、睪丸、皮膚高表達(dá),肺表達(dá)量最低,這些數(shù)據(jù)可能為進(jìn)一步了解及研究cirp蛋白在牦牛適應(yīng)高原方面所發(fā)揮的作用提供資料。(2)冷誘導(dǎo)rna結(jié)合蛋白是目前哺乳動(dòng)物中被廣泛研究的冷應(yīng)激蛋白之一。分析cirp在牦牛睪丸不同發(fā)育階段的表達(dá)變化,探究其在牦牛睪丸發(fā)育過程中所起的作用,為進(jìn)一步揭示cirp在高原哺乳動(dòng)物精子發(fā)生及睪丸相關(guān)功能調(diào)節(jié)過程中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr(qrt-pcr)、westernblot及免疫組織化學(xué)sabc法檢測(cè)1日齡、5月齡、1歲及3歲牦牛睪丸cirpmrna及蛋白的表達(dá)。rt-pcr反應(yīng)擴(kuò)增得到牦牛cirpmrna序列編碼區(qū)長(zhǎng)為642bp,編碼213個(gè)氨基酸,編碼蛋白大小約為23kd,與家牛有較高的同源性。實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr和westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,cirpmrna及蛋白在各年齡牦牛睪丸中均有表達(dá),且隨著年齡的增長(zhǎng),表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,1日齡牦牛睪丸曲細(xì)精管上皮中可觀察到較弱的免疫陽性反應(yīng),陽性細(xì)胞為精原細(xì)胞;5月齡曲細(xì)精管上皮cirp表達(dá)較豐富,陽性細(xì)胞仍為精原細(xì)胞;1歲曲細(xì)精管上皮出現(xiàn)初級(jí)精母細(xì)胞,并與精原細(xì)胞表達(dá)陽性;3歲牦牛睪丸發(fā)育成熟,曲細(xì)精管表達(dá)強(qiáng)烈,陽性細(xì)胞為精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞且主要位于細(xì)胞核內(nèi)。綜上所述,牦牛睪丸中cirp表達(dá)量隨年齡增長(zhǎng)而變高,這提示cirp可能對(duì)牦牛睪丸發(fā)育及生精細(xì)胞的增殖分化具有調(diào)控和保護(hù)作用。(3)細(xì)胞冷應(yīng)激反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過程,它包括低溫本身的應(yīng)激階段和復(fù)溫后的應(yīng)激階段,本研究以牦牛卵泡顆粒細(xì)胞為研究對(duì)象,利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr、westernblot技術(shù),分析溫和冷處理(25℃)1d、5d及復(fù)溫1、2、4、8及24h條件下,細(xì)胞內(nèi)cirp、hsp70及p53變化規(guī)律。結(jié)果顯示,細(xì)胞在25℃培養(yǎng)5d,然后通過復(fù)溫至37℃,會(huì)影響細(xì)胞生理狀態(tài)以及誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。cirp的表達(dá)量在25℃溫和冷處理第1天開始上升,并且在復(fù)溫后24h左右恢復(fù)到正常水平。hsp70的表達(dá)量在37℃復(fù)溫培養(yǎng)后逐步上升,復(fù)溫8h出現(xiàn)峰值,隨后下降。p53mrna表達(dá)水平在復(fù)溫培養(yǎng)4h出現(xiàn)峰值,隨后下降,并且在cirp及hsp70mrna高表達(dá)時(shí),均有明顯的下降。結(jié)果表明,低溫會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞cirpmrna和蛋白表達(dá)水平的上升;hsp70能夠被冷應(yīng)激后的復(fù)溫誘導(dǎo);cirp和hsp70都具有抗應(yīng)激損害和細(xì)胞凋亡的作用。這些數(shù)據(jù)將為亞低溫和復(fù)溫應(yīng)激在各種研究和治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S823.85

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