【摘要】：干旱是影響植物生存、生長和分布的最重要的非生物脅迫之一。據(jù)估計,全球由于缺水而導致的農(nóng)作物減產(chǎn)占所有環(huán)境因素導致的作物減產(chǎn)的50%以上。棉花是世界上最主要的經(jīng)濟作物之一,由于我國新疆及長江流域(特別是湖北、湖南、江西等省)夏秋時節(jié)經(jīng)常晴熱少雨,伏旱的發(fā)生比較頻繁,造成棉花水分供需失調(diào),葉片萎蔫,植株生長發(fā)育受阻,棉鈴脫落嚴重,對棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)影響非常大。因此,研究提高棉花的抗旱性,對于我國棉花產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展極其重要。蛋白的可逆磷酸化在各種信號轉(zhuǎn)導中起著非常重要的作用,調(diào)控著真核生物中大多數(shù)的生物學過程。蛋白激酶(PK)和磷酸酶(PPs)對于細胞在正常和逆境條件下磷酸化狀態(tài)的維持是非常關鍵的。已有研究發(fā)現(xiàn)蛋白磷酸酶對生物體內(nèi)的有關代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用。其中,PP2C蛋白磷酸酶在調(diào)控細胞周期、脅迫信號轉(zhuǎn)導、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯及翻譯后修飾等細胞活動過程中發(fā)揮重要的作用。在植物中,除了報道較多的A類PP2Cs外,其他類別的PP2C也在植物發(fā)育和抗逆性方面發(fā)揮重要作用。作為植物體內(nèi)較大的一類蛋白磷酸酶家族,PP2C具有特殊的結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì),并參與植物體內(nèi)多種信號途徑,而植物體內(nèi)PP2C家族蛋白的多樣性則表明其在不同的組織和器官中信號轉(zhuǎn)導機制的多樣性。但是,要清楚地了解PP2C蛋白的分子功能和作用機制是一項艱巨的工作。而且,在PP2C蛋白磷酸酶在植物抗逆過程中的直接作用底物的研究方面,目前仍然不是很清楚,特別是棉花中關于PP2C功能的報道極少。因此,對于PP2C蛋白在棉花抗逆中的功能研究具有重要理論意義和應用價值。利用轉(zhuǎn)錄組測序技術等方法,本文對兩個具有不同抗旱性的棉花品種在干旱脅迫下的葉片轉(zhuǎn)錄組進行了比較分析,發(fā)現(xiàn)有許多基因在干旱脅迫下差異表達。在上調(diào)表達的基因中,鑒定了一個編碼PP2C蛋白的基因,命名為GhDRPP1(DroughtRelatedPP2C1)。利用過量表達和基因沉默的技術方法,本文對GhDRPP1在棉花干旱應答過程中的功能及作用機制進行了研究,獲得以下主要結(jié)果:1.抗旱品種晉棉13號和干旱敏感品種魯棉6號在干旱脅迫下的比較轉(zhuǎn)錄組分析采用RNA-Seq技術對抗旱品種晉棉13號和干旱敏感品種魯棉6號在干旱處理時期的葉片進行比較轉(zhuǎn)錄組分析。差異表達基因的統(tǒng)計結(jié)果顯示,在干旱脅迫下大約有13.38%～18.75%Unigene的表達發(fā)生了變化,與對照相比,晉棉13號植株中差異表達基因的數(shù)量隨著干旱處理時間增加而增加;GO功能聚類分析顯示,很大一部分差異表達基因涉及到代謝、運輸、防御應答、蛋白質(zhì)修飾、激素信號應答等生物學過程,這表明干旱脅迫影響棉花的生長發(fā)育和代謝過程;對晉棉13號在整個干旱時期的差異表達基因進行共差異表達分析時發(fā)現(xiàn),與對照組相比,晉棉13號有627個基因持續(xù)上調(diào)表達,229個基因持續(xù)下調(diào)表達,這說明持續(xù)的干旱脅迫引起細胞內(nèi)一些特定的基因表達變化來調(diào)控棉花抗旱應答過程;細胞壁合成、非生物脅迫應答、ABA信號應答、碳水化合物的合成與代謝等相關基因在干旱處理的整個過程中都富集性高表達,而乙烯信號通路相關基因富集性低表達,暗示了晉棉13號可能通過激活ABA信號通路和其他代謝通路相關基因的表達來抵御干旱脅迫。干旱處理6 d的晉棉13號和魯棉6號之間的差異表達基因的統(tǒng)計結(jié)果顯示,大約一萬多個基因發(fā)生了差異表達;與魯棉6號相比,非生物脅迫應答、細菌防御應答、葡萄糖轉(zhuǎn)移酶、ABA信號應答等相關基因在晉棉13號中富集性高表達,乙烯、茉莉酸合成與代謝通路等相關基因低表達,暗示了這些信號通路可能參與棉花對干旱脅迫的響應及耐受性。2.GhDRPP1基因的克隆鑒定及表達分析通過上述轉(zhuǎn)錄組分析,從棉花中分離鑒定了一個PP2C家族基因,命名為GhDRPPl(CotAD_18479)。表達分析結(jié)果顯示,GhDRPP1在棉花各組織中均有表達,并且該基因在棉花葉片和根中的表達受ABA、甘露醇、NaC1的強烈誘導;在干旱處理時期,GhDRPP1在晉棉13和魯棉6號的棉花葉片中都顯著上調(diào)表達。干旱處理3 d和5 d時,晉棉13中GhDRPP1基因的表達量要高于魯棉6號,這表明GhDRPP1是一個受干旱脅迫誘導的基因,可能參與棉花干旱脅迫的應答過程。3.GhDRPP1編碼一個PP2C蛋白磷酸酶GhDRPP1蛋白比對和進化分析的結(jié)果顯示,該蛋白可能是一個PP2C蛋白磷酸酶。亞細胞定位結(jié)果顯示,該蛋白定位在細胞核中;構(gòu)建了 MBP-GhDRPP1的融合表達載體,在體外對GhDRPP1蛋白磷酸酶的活性進行了測定分析,結(jié)果顯示該蛋白具有PP2C蛋白磷酸酶的活性。4.過量表達GhDRPP1導致轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱敏感構(gòu)建了 GhD/RPP1過量表達載體,轉(zhuǎn)化擬南芥,獲得轉(zhuǎn)基因植株。對轉(zhuǎn)基因擬南芥在ABA和甘露醇處理條件下種子萌發(fā)率和綠苗率進行了分析,結(jié)果顯示ABA處理條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)率和綠苗率要高于野生型,而甘露醇處理條件下種子萌發(fā)率和綠苗率要低于野生型,說明GhDRPP1過量表達導致擬南芥對ABA不敏感和對甘露醇敏感;轉(zhuǎn)基因擬南芥干旱處理后的表型觀察結(jié)果顯示,干旱處理20 d后GhDRPP1過量表達轉(zhuǎn)基因擬南芥出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象,而野生型擬南芥植株生長狀態(tài)良好;干旱23 d后對植株進行復水,并對復水2 d后植株的成活率進行統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株的成活率顯著低于野生型,上述結(jié)果說明GhDRPP1的過量表達增加了擬南芥對干旱的敏感性,導致植株不耐旱。對ABA和甘露醇處理條件下的GhDRPP1過量表達轉(zhuǎn)基因植株中ABA和脅迫應答相關基因的表達進行分析,結(jié)果顯示在ABA和甘露醇處理后,轉(zhuǎn)基因植株中RD22、COR15、NHX1、CBF3基因的表達量均顯著低于野生型。這些結(jié)果暗示了 GhDRPP1過量表達植株對干旱敏感的表型可能是由于ABA和逆境脅迫應答相關基因的下調(diào)表達所引起的。5.GhDRPP1在棉花干旱應答過程中發(fā)揮重要作用構(gòu)建了GhDRPP 過量表達載體和基因沉默(RNA干擾)相關載體,分別轉(zhuǎn)化棉花,收獲T1和T2代種子后,分別對T1和T2代轉(zhuǎn)基因棉花表型進行了分析,結(jié)果顯示GhDRPP1的過量表達棉花植株相對于野生型干旱敏感,而GhDRPP1RNAi棉花植株相對于野生型更加耐旱。生理指標的測定結(jié)果顯示,在干旱處理條件下GhDRPP1的過量表達棉花植株中的MDA和H202的含量都高于野生型,而GhDRPP1RNAi棉花植株中的MDA和H202的含量都低于野生型,說明GhDRPP1的過量表達植株受到干旱脅迫的影響更加嚴重;相反,植物體內(nèi)的清除ROS相關的保護性酶的酶含量(如SOD、POD等)在GhLDRPR1RNAi植株中高于野生型,而在GhDRPP1過量表達植株中低于野生型,脯氨酸含量的測定也得到類似結(jié)果,這說明GhDRPP1RNAi植株耐旱能力的提高可能是由于增強了這些ROS清除酶含量和脯氨酸含量的原因;另外,脅迫應答相關基因(如GXH-PX8、GST8、RD22、KIN10等)的表達在GhDRPP1RNAi植株中高于野生型,而在GhDRPP1過量表達植株中低于野生型,這些結(jié)果說明,GhDRPP1RNAi植株可能通過增強脅迫相關基因的表達來抵御干旱脅迫。6.GhDRPP1互作蛋白的篩選及相互作用分析為了研究GhDRPP1在棉花抗旱中的作用機制和分子功能,構(gòu)建了干旱脅迫下棉花葉片的酵母雙雜交cDNA文庫,以GhDRPP1為誘餌蛋白篩選互作蛋白。發(fā)現(xiàn)在所篩選出的23個候選蛋白中,有兩個感興趣的GhDRPP1的互作蛋白,它們與GhDRPP1在棉花抗旱中的功能有待進一步深入研究。此外,酵母雙雜交實驗結(jié)果顯示,GhDRPP1與GhPYL蛋白相互作用具有選擇性。
【學位授予單位】：華中師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S562;Q943.2
【圖文】：

進而調(diào)節(jié)植物的脅迫應答。ＲＯＳ也能激活一些轉(zhuǎn)錄因子的的活性，如ＷＲＫＹ，Ｚａｔ，邋ＲＡＶ，逡逑ＧＲＡＳ，邋Ｍｙｂ等（ＴｒｉｐａｔｈｙａｎｄＯｅｌｍａｌｌｅｒ２０１２），說明ＲＯＳ與生物和非生物脅迫之間存在著緊密的逡逑聯(lián)系。保衛(wèi)細胞中ＲＯＳ的信號轉(zhuǎn)導見圖１－３。逡逑８逡逑

２００９；邋Ｓａｎｔｉａｇｏ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００９；邋Ｙｉｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００９；邋Ｍｉｙａｋａｗａ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１２；邋Ｗｅｓｔ邋ｅｔ邋ａｌ＿，邋２０１３）�！板彘T邋Ｒ”邋的關逡逑閉使得ＰＹＬｓ蛋白暴露出與Ａ類蛋白磷酸酶２Ｃ（ｃｌａｄｅ邋Ａ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ邋２Ｃ，ＰＰ２Ｃ）結(jié)合的表逡逑面，特異性的識別與結(jié)合ＰＰ２Ｃ上的Ｔｒｐ殘基（圖１－５）。逡逑？通邋一逡逑圖１－５邋ＰＹＲ／ＰＹＬ／ＲＣＡＲ識別ＡＢＡ信號的結(jié)構(gòu)模式圖逡逑Ａ，ＰＹＲ／ＰＹＬ／ＲＣＡＲ蛋白與ＡＢＡ的特異性結(jié)合；Ｂ，邋ＡＢＡ誘導ＰＹＲ／ＰＹＬ／ＲＣＡＲ的構(gòu)象逡逑改變；Ｃ，邋ＰＹＲ／ＰＹＬ／ＲＣＡＲ邋對邋ＰＰ２Ｃ邋活性的抑制（Ｕｍｅｚａｗａｅｔａｌ．，２０１０）逡逑Ｆｉｇ．邋１－＾邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋ｐａｔｔｅｒｎ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ＰＹＲ／ＰＹＬ／ＲＣＡＲ邋ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ邋ｔｈｅ邋ＡＢＡ邋ｓｉｇｎａｌ邋（Ｕｍｅｚａｗａ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２ｕｉ０）．逡逑Ａ，邋Ｔｈｅ邋ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｏｆ邋ＰＹＲ／ＰＹＬ／ＲＣＡＲ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｔｏ邋ＡＢＡ；邋Ｂ，邋Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｏｆ逡逑ＰＹＲ／ＰＹＬ／ＲＣＡＲ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ＡＢＡ；邋Ｃ，ＰＰ２Ｃ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｗａｓ邋ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ邋ｂｙ邋ＰＹＲ／ＰＹＬ／ＲＣＡＲ．逡逑ＡＢＡ與其受體ＰＹＬ結(jié)合后促進ＰＹＬ與ＰＰ２Ｃ結(jié)合，形成ＡＢＡ－ＰＹＬＰＰ２Ｃ三元復合體，這逡逑樣就使得被ＰＰ２Ｃ去磷酸化而失活的ＳｎＲＫｓ重新被磷酸化而激活（Ｆｕｊｉｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００９；邋Ｍｅｌｃｈｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２００９）

ＰＰ２邋咕邐ＲＰＫ１邐ＣＲＫ３ｇ邐Ｍｈｌ：１邐Ｒ0Ｓ逡逑圖１－７擬南芥中參與ＡＢＡ信號通路的蛋白激酶和磷酸酶以及它們可能的作用機制（Ｚｈａｎｇ，邋２０１４）逡逑Ｆｉｇ．邋１－７邋Ａ邋ｓｕｍｍａｒｙ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅｓ邋ａｎｄ邋ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ邋ｉｎｖｏｌｖｅｄ邋ｉｎ邋ＡＢＡ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ａｎｄ邋ｔｈｅｉｒ逡逑ｐｏｓｓｉｂｌｅ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｐｌａｎｔ邋Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ邋（Ｚｈａｎｇ，邋２０１４）．逡逑１．２植物蛋白磷酸酶ＰＰ２Ｃ研究進展逡逑蛋白的可逆磷酸化在各種信號轉(zhuǎn)導中起著非常重要的作用，調(diào)控著真核生物中大多數(shù)的生逡逑物學過程（Ｕｈｒｉｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１３）。蛋白激酶（ＰＫ）和磷酸酶（ＰＰｓ）對于細胞在正常條件下和不利條件下逡逑淲酸化狀態(tài)的維持是非常關鍵的（Ｓｉｎｇｈ邋ａｎｄ邋Ｐａｎｄｅｙ，邋２０１２）。目前在植物中己確定了多種蛋白激酶逡逑和蛋白磷酸酶。有關蛋白激酶方面的研究較多，而蛋白磷酸酶方面的研究較少，現(xiàn)有的研究己逡逑發(fā)現(xiàn)蛋白磷酸酶和蛋白激酶一樣被受到嚴密的調(diào)控（阮海華，２００７），同樣對生物體內(nèi)的有關代逡逑謝起重要的調(diào)節(jié)作用。ＰＰ２Ｃｓ通過去磷酸化作用負調(diào)控蛋白激酶級聯(lián)信號系統(tǒng)，在細胞周期、逡逑脅迫信號轉(zhuǎn)導、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯及翻譯后修飾等細胞活動過程起重要的調(diào)節(jié)作用。逡逑（１）ＰＰ２Ｃ的結(jié)構(gòu)逡逑ＰＰ２Ｃ是一類含絲氨酸／蘇氨酸殘基的蛋白磷酸酶

本文編號：2782936