【摘要】：牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)是我國的十大名花之首,是美好、幸福、吉祥、富貴的象征,深受世界各國人民的喜愛。牡丹的正常花期在每年4-5月份,盡管現(xiàn)在已通過牡丹春節(jié)催花技術(shù)實(shí)現(xiàn)了人們春節(jié)賞花的愿望,但由于牡丹的自然花期比較短,一般僅為7天左右,因此仍不能滿足人們賞花的愿望。牡丹的花期長短,直接影響到牡丹的觀賞質(zhì)量和牡丹產(chǎn)區(qū)的經(jīng)濟(jì)效益。延緩牡丹花衰老,延長牡丹花期對促進(jìn)旅游業(yè)的發(fā)展具有積極意義,已成為當(dāng)前急需解決的重要課題之一。本研究以牡丹‘魯菏紅’為試驗(yàn)材料,通過觀察自然條件下牡丹花衰老過程中形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)的變化,確定了牡丹花的衰老時期。利用抑制性消減雜交技術(shù),構(gòu)建了牡丹花衰老相關(guān)基因的抑制消減雜交文庫。通過RACE擴(kuò)增得到3個牡丹花衰老相關(guān)基因的cDNA全長,并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。構(gòu)建了pBI121-PsMADS4的超表達(dá)載體,利用花序侵染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥,觀察PsMADS4轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型特征。其主要研究結(jié)果如下：1.通過對自然條件下牡丹花衰老過程中花的外形和石蠟組織切片的觀察,發(fā)現(xiàn)花瓣的組織結(jié)構(gòu)變化趨勢和花發(fā)育不同時期的形態(tài)學(xué)變化趨勢基本一致,并最終確定牡丹花的衰老時期。2.分別以盛開花瓣和衰老花瓣作為tester (driver)和driver (tester),構(gòu)建牡丹花衰老相關(guān)的正向和反向抑制消減雜交文庫,最終分離得到211個有效表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)序列。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫的BLAST結(jié)果,有48個EST序列得到功能注釋。將所得211條EST使用COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行直系同源聚類分析,發(fā)現(xiàn)其中44條EST序列被分成14類：未知功能預(yù)測；碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn),翻譯后修飾和分子伴侶；翻譯,核糖體結(jié)構(gòu)和生物轉(zhuǎn)化；脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；細(xì)胞骨架；轉(zhuǎn)錄；細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的生物合成；胞內(nèi)運(yùn)輸,分泌和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)；防御機(jī)制；氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；次生代謝物的合成,轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝；復(fù)制,重組和修復(fù)。為進(jìn)一步分析差異表達(dá)基因在不同花衰老時期的表達(dá)情況,從211條EST序列中隨機(jī)選取23條EST進(jìn)行qRT-PCR分析,結(jié)果表明,qRT-PCR結(jié)果與花衰老相關(guān)的抑制消減雜交結(jié)果相一致。3.根據(jù)消減文庫中獲得的長鏈脂酰輔酶A基因的EST序列設(shè)計引物,利用RACE擴(kuò)增得到2377 bp的PsLACS全長cDNA,其中包含1830 bp的編碼區(qū),共編碼609個氨基酸,分子量為67.94 KD,等電點(diǎn)為6.191。PsLACS包括30個可能的磷酸化位點(diǎn),這可能與酶活性的調(diào)節(jié)有關(guān)。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示,PsLACS含α-螺旋和無規(guī)則卷曲較多。同源性分析結(jié)果表明,PsLACS與葡萄LACS同源性最高,其次是橙子LACS、蓖麻LACS。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果與同源性比對的結(jié)果基本一致。4.質(zhì)膜內(nèi)在蛋白作為水通道蛋白的一種存在類型,在跨膜水分運(yùn)輸中起著重要作用。以消減文庫中獲得的水通道蛋白基因的EST序列為模板設(shè)計引物,利用RACE擴(kuò)增得到1174 bp的PsPIP2全長cDNA,其中包含846 bp的編碼區(qū),共編碼281個氨基酸,分子量為29.79 KD,理論等電點(diǎn)為9.04。PsPIP2包括8個可能的磷酸化位點(diǎn),推測這些磷酸化修飾位點(diǎn)可能與PsPIP2蛋白通道的開啟與閉合相關(guān)。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示,PsPIP2含無規(guī)卷曲和a-螺旋較多。同源性分析結(jié)果表明,PsPIP2與木薯PIP2同源性最高。5.PsMADS4是從消減文庫中分離到的一個在盛花期表達(dá)量明顯升高的EST。通過RACE-RCR技術(shù)擴(kuò)增獲得1081 bp的PsMADS4全長cDNA序列,其中107-844 bp為開放閱讀框,總計738 bp,編碼245個氨基酸,具有兩個保守結(jié)構(gòu)域,其中MADS-box結(jié)構(gòu)域在3-75位氨基酸,K-box結(jié)構(gòu)域在89-176位氨基酸。PsMADS4在擬南芥中的超表達(dá)研究表明,轉(zhuǎn)基因擬南芥的開花時間早于野生型,但花期僅略長于野生型擬南芥的花期。
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S685.11
【圖文】：

對牡丹花發(fā)育時期外觀形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，在整個花發(fā)育時期，牡丹花的外觀形態(tài)逡逑發(fā)生了明顯的變化。牡丹花在ＤＯ時期處于花蕾狀態(tài)，外層花瓣微微張開，處于初開期逡逑（圖２－ｌａ）；邋ＤＯ時期之后的第Ｈ天（Ｄ３），每層花瓣都完全展開，花徑達(dá)到最大，色澤逡逑亮麗，花型花色得到充分顯現(xiàn)，并且散發(fā)著香味，此時處于盛開狀態(tài)（圖２－化）；ＤＯ逡逑時期之后的第六天（Ｄ６），花瓣顏色逐漸泛白，并且開始調(diào)萎脫落，同時，雄蕊開始脫逡逑落，整朵花開始處于萎嘉的狀態(tài)（圖２－ｌｃ）。通過對牡丹花發(fā)育時期外觀形態(tài)的觀察，逡逑我們將牡丹的ＤＯ時期確定初開期，Ｄ３時期確定為盛花期，Ｄ６時期確定為衰老期或謝逡逑花期。在本文Ｗ后的試驗(yàn)中都遵循此處的標(biāo)準(zhǔn)。逡逑圖２－１巧丹花不同發(fā)育時期的形態(tài)變化逡逑ａ：邋ＤＯ時期；ｂ：邋Ｄ３時期；Ｃ：邋Ｄ６時期逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｔｒｅｅ邋ｐｅｏｎｙ邋ｆｌｏｗｅｒ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ邋ｓｔａｇｅ逡逑ａ：邋ＤＯ邋ｓｔａｇｅ；邋ｂ：邋Ｄ３邋ｓｔａｇｅ；邋ｃ：邋Ｄ６邋ｓｔａｇｅ逡逑２．２巧丹花不同發(fā)育時期的組織結(jié)構(gòu)變化逡逑根據(jù)對牡丹花發(fā)育時期外觀形態(tài)的觀察，選擇了邋ＤＯ、Ｄ３和Ｄ６這三個花發(fā)育時期逡逑的花瓣，制作石蠟切片，并發(fā)現(xiàn)在整個花發(fā)育時期，牡丹花瓣的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯逡逑的變化。在ＤＯ、Ｄ３和Ｄ６時期，花瓣的上表皮細(xì)胞和下表皮細(xì)胞均非常完整（圖２－２）。逡逑但在ＤＯ時期

對牡丹花發(fā)育時期外觀形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，在整個花發(fā)育時期，牡丹花的外觀形態(tài)逡逑發(fā)生了明顯的變化。牡丹花在ＤＯ時期處于花蕾狀態(tài)，外層花瓣微微張開，處于初開期逡逑（圖２－ｌａ）；邋ＤＯ時期之后的第Ｈ天（Ｄ３），每層花瓣都完全展開，花徑達(dá)到最大，色澤逡逑亮麗，花型花色得到充分顯現(xiàn)，并且散發(fā)著香味，此時處于盛開狀態(tài)（圖２－化）；ＤＯ逡逑時期之后的第六天（Ｄ６），花瓣顏色逐漸泛白，并且開始調(diào)萎脫落，同時，雄蕊開始脫逡逑落，整朵花開始處于萎嘉的狀態(tài)（圖２－ｌｃ）。通過對牡丹花發(fā)育時期外觀形態(tài)的觀察，逡逑我們將牡丹的ＤＯ時期確定初開期，Ｄ３時期確定為盛花期，Ｄ６時期確定為衰老期或謝逡逑花期。在本文Ｗ后的試驗(yàn)中都遵循此處的標(biāo)準(zhǔn)。逡逑圖２－１巧丹花不同發(fā)育時期的形態(tài)變化逡逑ａ：邋ＤＯ時期；ｂ：邋Ｄ３時期；Ｃ：邋Ｄ６時期逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｔｒｅｅ邋ｐｅｏｎｙ邋ｆｌｏｗｅｒ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ邋ｓｔａｇｅ逡逑ａ：邋ＤＯ邋ｓｔａｇｅ；邋ｂ：邋Ｄ３邋ｓｔａｇｅ；邋ｃ：邋Ｄ６邋ｓｔａｇｅ逡逑２．２巧丹花不同發(fā)育時期的組織結(jié)構(gòu)變化逡逑根據(jù)對牡丹花發(fā)育時期外觀形態(tài)的觀察，選擇了邋ＤＯ、Ｄ３和Ｄ６這三個花發(fā)育時期逡逑的花瓣，制作石蠟切片，并發(fā)現(xiàn)在整個花發(fā)育時期，牡丹花瓣的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯逡逑的變化。在ＤＯ、Ｄ３和Ｄ６時期，花瓣的上表皮細(xì)胞和下表皮細(xì)胞均非常完整（圖２－２）。逡逑但在ＤＯ時期

因?yàn)樵冢悖模危梁铣蛇^程中加入１咕總ＲＮＡ，造成ｃＤＮＡ合成反應(yīng)體系中總ＲＮＡ逡逑的量大于１００邋ｎｇ，故在接下來的ｃＤＮＡ擴(kuò)增過程中需將上述ｃＤＮＡ合成產(chǎn)物進(jìn)行稀釋逡逑后再作為擴(kuò)增模板。圖３－２的結(jié)果表明，盛開和衰老樣品的ｃＤＮＡ擴(kuò)增產(chǎn)物在開始時逡逑隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加而增加，但在進(jìn)行到２１個循環(huán)時達(dá)到平臺期，之后盡管循環(huán)數(shù)逡逑增加，其擴(kuò)增產(chǎn)物也不再增加，并且在高分子量ｃＤＮＡ條帶處出現(xiàn)彌散條帶，送說明逡逑循環(huán)數(shù)過多。循環(huán)數(shù)過多時所得到的ｃＤＮＡ不利于ｃＤＮＡ的消減雜交。由于比達(dá)到擴(kuò)逡逑增平臺期少１個循環(huán)是最佳循環(huán)數(shù)，因此確定盛開和衰老樣品ｃＤＮＡ的最優(yōu)循環(huán)數(shù)均逡逑為２０。對柱層析純化后的ｄｓ邋ｃＤＮＡ進(jìn)行電泳檢測，發(fā)現(xiàn)ｄｓ邋ｃＤＮＡ范圍在０．５－１０化（圖逡逑３－３）。逡逑４２逡逑

本文編號：2744719