【摘要】：豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是導(dǎo)致豬流行性腹瀉(PED)的致病因子,可引發(fā)嚴(yán)重腹瀉和脫水,誘發(fā)高死亡率和發(fā)病率,嚴(yán)重影響了世界各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,并造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。雖然該病在其分子流行病學(xué)的調(diào)查、診斷、預(yù)防及治療方面的研究已有一定的進(jìn)展,但是該病的爆發(fā)仍然呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)。為了有效的控制該病的發(fā)生,有必要深入了解PEDV的分子致病機(jī)制。其中PEDV與宿主天然免疫系統(tǒng)之間的相互作用的研究可以幫助人們更好的理解PEDV感染和疾病發(fā)生的分子機(jī)制。PEDV感染后,不能誘導(dǎo)產(chǎn)生I型干擾素(IFN),為PEDV逃避宿主天然免疫反應(yīng)提供了有利地條件。另外,人們發(fā)現(xiàn)病毒感染機(jī)體后可以根據(jù)自身的特性激活或抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)基因的轉(zhuǎn)錄。然而,PEDV感染不能誘導(dǎo)產(chǎn)生I型IFN及是否激活NF-κB的具體機(jī)制仍不清楚。PEDV感染機(jī)體主要破壞豬腸道上皮組織,引起腸道充血及腸絨毛萎縮,結(jié)果導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞胞漿空泡化,脫落。因此,豬小腸上皮細(xì)胞(IECs)是PEDV感染的靶細(xì)胞。為了揭示了PEDV逃避天然免疫的機(jī)制,本研究選用IECs細(xì)胞作為PEDV的感染模型,對(duì)PEDV感染IECs后天然免疫反應(yīng)信號(hào)通路進(jìn)行了較為系統(tǒng)的初步研究。在病毒感染和復(fù)制時(shí),宿主的天然免疫應(yīng)答反應(yīng)是抵抗其感染的第一道防線,因此,病毒抑制或逃避該免疫應(yīng)答反應(yīng)的能力在一定程度上也反應(yīng)了病毒致病力的強(qiáng)弱。I型干擾素是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要產(chǎn)物之一,本研究顯示PEDV感染IECs細(xì)胞不僅抑制IFN-β的產(chǎn)生,而且還抑制雙鏈RNA(ds RNA)誘導(dǎo)的IFN-β的表達(dá)。干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF-3)和NF-κB是誘導(dǎo)IFN-β發(fā)生轉(zhuǎn)錄的兩個(gè)關(guān)鍵因子。我們發(fā)現(xiàn)PEDV感染能激活NF-κB,但不能激活I(lǐng)RF-3。此外,PEDV感染能明顯抑制ds RNA誘導(dǎo)的IRF-3的核轉(zhuǎn)位及IFN-β的產(chǎn)生。為了闡明PEDV感染抑制IRF-3激活的分子機(jī)制,我們研究了IRF-3上游的組成視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白(RIG-I)和Toll-樣受體3(TLR3)信號(hào)通路的信號(hào)分子誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生。在IRF-3的上游,我們發(fā)現(xiàn)TANK結(jié)合激酶1(TBK1)或抑制性κB激酶ε(IKKε)介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生并不受PEDV感染的影響,但是PEDV感染卻完全抑制了RIG-I接頭分子線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(MAVS)及RIG-I介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生,說(shuō)明PEDV感染主要通過(guò)干擾RIG-I信號(hào)通路中的MAVS的活性而抑制IFN-β的產(chǎn)生。此外,我們還發(fā)現(xiàn)PEDV感染只能部分抑制TIR結(jié)構(gòu)域的接頭分子l(TRIF)誘導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生,TRIF是TLR3信號(hào)通路的組成部分。綜上表明,PEDV感染抑制IFN-β的產(chǎn)生主要是由于阻斷了RIG-I信號(hào)通路所致。NF-κB調(diào)節(jié)組成免疫系統(tǒng)的多種因子,包括多種前炎癥因子,趨化因子、黏附分子、誘導(dǎo)酶的表達(dá)及細(xì)胞的增殖。但是過(guò)度激活NF-κB將會(huì)引起炎癥及自身免疫性疾病,因此,人們常將NF-κB的激活也認(rèn)為是多數(shù)疾病感染的標(biāo)志。本研究中,我們首次報(bào)道在PEDV感染IECs細(xì)胞能激活NF-κB。在PEDV感染的細(xì)胞中,NF-κB激活特征表現(xiàn)在NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞核,而且增強(qiáng)了NF-κB調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。NF-κB的激活隨病毒的感染進(jìn)程及劑量的增加而增強(qiáng)。紫外滅活的PEDV不能誘導(dǎo)NF-κB的激活。我們?cè)赑EDV感染的細(xì)胞中檢測(cè)到IκBα蛋白有降解的趨勢(shì),這說(shuō)明NF-κB的激活可能與IκBα蛋白的降解有關(guān)。為了進(jìn)一步揭示PEDV誘導(dǎo)NF-κB激活的機(jī)制,我們研究了NF-κB激活的上游信號(hào)通路,視黃酸誘導(dǎo)基因基因I樣受體(RLRs)和TLRs信號(hào)通路。通過(guò)小分子RNA干擾(si RNA)試驗(yàn),我們的研究結(jié)果表明PEDV可能通過(guò)TLRs信號(hào)通路中的接頭分子TRIF和My D88激活NF-κB,而與RLRs相關(guān)的RIG-I信號(hào)通路無(wú)關(guān)。我們?cè)俅瓮ㄟ^(guò)對(duì)TLRs家族中的TLR2,TLR3,TLR4,TLR8及TLR9基因沉默,發(fā)現(xiàn)在PEDV感染的細(xì)胞中TLR2,TLR3及TLR9基因沉默后明顯抑制了NF-κB調(diào)節(jié)基因的表達(dá)及NF-κB的核易位,而TLR4和TLR8基因沉默并沒(méi)有影響PEDV誘導(dǎo)NF-κB的激活。已經(jīng)有研究證實(shí)病毒核酸編碼的蛋白參與調(diào)節(jié)NF-κB的激活,因此,我們研究了PEDV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白在NF-κB激活中的作用。通過(guò)NF-κB熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)PEDV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白的篩選,我們發(fā)現(xiàn)PEDV核蛋白N能夠誘導(dǎo)NF-κB的激活。同時(shí)PEDV N蛋白誘導(dǎo)NF-κB的激活具有劑量依賴性。通過(guò)激光共聚焦實(shí)驗(yàn),我們檢測(cè)到在PEDV N蛋白轉(zhuǎn)染的IECs細(xì)胞中能促進(jìn)NF-κB的核易位。此外,通過(guò)對(duì)N蛋白缺失突變體的研究表明,PEDV N蛋白的中間區(qū)域是激活NF-κB所必須的區(qū)域。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí),TLR2信號(hào)通路參與PEDV N蛋白誘導(dǎo)NF-κB的激活�？傊�,本文的研究結(jié)果為深入了解PEDV的致病的分子致病機(jī)制和免疫逃避及PED的綜合防治提供了重要的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.28
【圖文】：

主要識(shí)別微生物的膜成分，如脂類、脂蛋白和其他一些蛋白(圖1-1)。圖 1-1 細(xì)胞膜表面的 TLRs 識(shí)別的病原相關(guān)分子模式[12]Fig. 1-1 PAMP recognition by cell surface TLRsTLR2 識(shí)別廣泛的 PAMPs，如細(xì)菌、真菌、寄生蟲及病毒的衍生物[3]。這些包括來(lái)自細(xì)菌的脂肽，來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌的肽聚糖和脂磷壁酸，來(lái)自分支桿菌的脂阿拉伯甘露糖，來(lái)自真菌的酵母聚糖，來(lái)自克氏錐蟲的 tGPI-粘蛋白及來(lái)自麻疹病毒的血凝素蛋白。TLR2 與TLR1 或 TLR6 通常形成異源二聚體。具體地講，TLR2-TLR1 異二聚體識(shí)別來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌和支原體三�；模� TLR2-TLR6 異二聚體識(shí)別來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌和支原體二�；�。結(jié)構(gòu)分析表明，這些異二聚體能區(qū)分脂蛋白的結(jié)構(gòu)[4, 5]。TLR2-TLR1 和 TLR2-TLR6異二聚體共享一個(gè) M 形結(jié)構(gòu)。在 TLR2-TLR1-配體復(fù)合物中，三分之二的 Pam3CSK4 脂質(zhì)鏈與 TLR2 交互，而第三鏈結(jié)合 TLR1 的疏水通道。因此

TLR9 缺陷型鼠分析表明，TLR9 是 CpG DNA 的受體[22]。細(xì)菌 DNA 中含有去甲基化G 基序，因此具有免疫激活活性。在脊椎動(dòng)物，CpG 基序的頻率被嚴(yán)重減少和 CpG 半胱氨酸殘基高度甲基化，導(dǎo)致免疫刺激活性的廢除。至少存在兩種類型的 CpG DN：A/D 型和 B/K 型。B/K 型 CpG DNA 是傳統(tǒng)的、最先被鑒定出來(lái)的，并且是炎癥因子-12 和 TNF α的誘導(dǎo)劑。A/D 型 CpG-DNA 在結(jié)構(gòu)上不同于傳統(tǒng)的 CpG DNA，在 p誘導(dǎo)大量的 IFN-α產(chǎn)生，但不具有誘導(dǎo) IL-12 的能力。TLR9 能識(shí)別這兩種類型的 A。事實(shí)上在 pDCs 中，TLR9 識(shí)別 A/D 型 CpG-DNA 從而刺激細(xì)胞產(chǎn)生大量的抗病因子 IFN-α，這說(shuō)明 TLR9 參與病毒識(shí)別。的確 TLR9 除了識(shí)別細(xì)菌 CpG DNA 外，別病毒衍生的 CpG DNA。而且 TLR9 變異小鼠表現(xiàn)出對(duì)鼠巨細(xì)胞病毒（MCMV）的23]。在 pDC 細(xì)胞或其他類型的 DC 細(xì)胞中，MCMV 的 TLR9 依賴性識(shí)別通過(guò)激活 N釋放抗 MCMV 應(yīng)答。除了細(xì)菌和病毒 CpG DNA，TLR9 可能還涉及自身免疫性疾病機(jī)理。通過(guò) B 細(xì)胞受體對(duì) IgG2a 染色質(zhì)復(fù)合物的一系列處理和 TLR9 通過(guò)自身反應(yīng)胞介導(dǎo)產(chǎn)生有效的類風(fēng)濕因子[24]。在此模型中，IgG2a 被 B 細(xì)胞受體綁定和內(nèi)化，包括低甲基化的 CpG 基序接合 TLR9，由此誘導(dǎo)類風(fēng)濕因子。同樣地，染色質(zhì)通過(guò) F內(nèi)化，然后暴露給 TLR9，TLR9 介導(dǎo) PDC 細(xì)胞通過(guò) IgG 和染色質(zhì)免疫復(fù)合物誘導(dǎo) ，這就是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的發(fā)病機(jī)理[25]。因此，TLR9 通過(guò)識(shí)別染色質(zhì)結(jié)構(gòu)種自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)理。

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前6條

1 孫立旦;趨化因子在豬流行性腹瀉病毒感染中的作用[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

2 王艷午;PEDV分子流行病學(xué)調(diào)查及其調(diào)控細(xì)胞因子的研究[D];華南農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 李葉珍;PEDV感染仔豬小腸黏膜組織RNA-Seq分析和機(jī)體TLRs分布特征[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

4 馮蕊;豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及其基因組測(cè)序分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

5 楊云喬;復(fù)方中藥對(duì)豬流行性腹瀉病的治療及其機(jī)理的探究[D];揚(yáng)州大學(xué);2017年

6 李紅杰;PEDV Nsp7對(duì)Ⅰ型IFN應(yīng)答的影響及基于Nsp7間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2740000