【摘要】：對(duì)蝦是重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一,由于各類病害的爆發(fā),對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)蝦抵御病原入侵的主要方式是啟動(dòng)先天免疫應(yīng)答系統(tǒng),通過產(chǎn)生免疫效應(yīng)分子,來清除各種病原�？咕淖鳛閷�(duì)蝦免疫應(yīng)答反應(yīng)產(chǎn)生的一類重要的效應(yīng)分子,在清除感染的外來病原的過程中起著重要作用�？怪嗵且蜃�(Anti-lipopolysaccharride factor,ALF)作為對(duì)蝦的一類重要的抗菌肽,在先天性免疫系統(tǒng)中起著重要作用。前期的研究表明,在中國(guó)對(duì)蝦體內(nèi)存在7種不同的ALF基因,其抗菌和抗WSSV活性存在著明顯差別,但是對(duì)于不同ALF的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,以及抑菌和抗病毒的作用機(jī)理了解較少,亟待深入研究。另外,由于傳統(tǒng)抗生素導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性的問題日益引起大家的關(guān)注,尋找新型抗菌活性物質(zhì)來替代傳統(tǒng)抗生素的需求更加迫切。抗菌肽由于其抗菌機(jī)理與傳統(tǒng)抗生素存在明顯差別,不會(huì)引起細(xì)菌耐藥性的問題,被認(rèn)為是抗生素的理想替代物。本論文為解決未來可能的應(yīng)用問題,通過對(duì)ALF的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造,以提高ALF的抗菌活性;同時(shí)也通過利用合成生物學(xué),原核和真核重組表達(dá)等方法,獲得了具有較高生物學(xué)活性的抗菌肽重組蛋白。本研究為抗菌肽產(chǎn)品的研發(fā),實(shí)現(xiàn)其在醫(yī)藥或水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。主要研究進(jìn)展如下:1.通過分析中國(guó)對(duì)蝦7種不同ALF的脂多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LPS binding domain,LBD)短肽的理化特征和功能活性的關(guān)系,推測(cè)LBD短肽中堿性氨基酸的數(shù)量以及親水和疏水氨基酸的空間排布共同決定著LBD短肽的抑菌活性。為證實(shí)此推斷,按照以上原則設(shè)計(jì)合成了一系列短肽,并對(duì)其最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明,有些結(jié)構(gòu)改造后的短肽殺菌能力明顯提高,在2-4μM的濃度下即可殺滅大腸桿菌,溶藻弧菌和哈維氏弧菌等,且對(duì)大部分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都具有一定的抑制效果。對(duì)這些改造后的LBD短肽的生物學(xué)活性和殺菌機(jī)理進(jìn)一步分析,結(jié)果表明,這些短肽具有很好的熱穩(wěn)定性,即使經(jīng)過了熱處理仍能在短時(shí)間內(nèi)殺滅細(xì)菌,其活性未發(fā)生明顯改變。通過對(duì)LBD短肽處理過的細(xì)菌進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)LBD短肽是通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞外膜,導(dǎo)致胞質(zhì)外溢而殺滅細(xì)菌的。圓二相色譜分析的結(jié)果表明,LBD短肽呈典型的β-sheet結(jié)構(gòu)。以上研究結(jié)果為高活性抗菌肽的設(shè)計(jì)和改造提供了重要依據(jù)。2.針對(duì)中國(guó)對(duì)蝦7種ALFs中的一種類型—Fc ALF5,其對(duì)大腸桿菌無抑制活性,而對(duì)WSSV有抑制活性的特點(diǎn),利用原核重組表達(dá)系統(tǒng)成功獲得了具有明顯抗WSSV活性的重組蛋白,并進(jìn)一步探討了其抗WSSV的作用機(jī)理。以重組的Fc ALF5為誘餌蛋白,利用Far Western Blot獲得了與其存在相互作用的WSSV蛋白,經(jīng)過LC-MS/MS分析鑒定,發(fā)現(xiàn)該蛋白與WSSV的囊膜蛋白VP24具有最高的相似性。進(jìn)一步利用原核重組表達(dá)獲得了VP24重組蛋白,利用點(diǎn)雜交和Far Western Blot驗(yàn)證了Fc ALF5與WSSV的VP24存在相互作用,同時(shí)利用FcALF5的LBD短肽也證實(shí)了其與VP24的相互作用。由于VP24是WSSV入侵細(xì)胞的一種重要的囊膜蛋白,因此推斷Fc ALF5發(fā)揮抗WSSV作用主要是通過LBD結(jié)構(gòu)域和VP24的相互作用來實(shí)現(xiàn)的。3.對(duì)FcALF2的LBD進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,抗菌活性明顯提高的一種類型(LBDv),替換對(duì)蝦Fc ALF2基因原有的結(jié)構(gòu)功能域,并結(jié)合酵母系統(tǒng)密碼子的偏好性,利用生物合成的方法合成該基因,并對(duì)該基因在宿主菌畢赤酵母GS115進(jìn)行重組表達(dá),成功獲得了目的蛋白。對(duì)重組表達(dá)獲得的蛋白進(jìn)行抗菌活性分析,結(jié)果表明,該蛋白具有明顯的抗菌和抗WSSV活性。此系統(tǒng)的建立為利用體外真核表達(dá)系統(tǒng)獲得重組蛋白并在生產(chǎn)上應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ),也為抗菌肽藥物的開發(fā)和利用提供了重要參考。
【圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述1.1 前言對(duì)蝦屬于節(jié)肢動(dòng)物門，甲殼動(dòng)物亞門，是水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要養(yǎng)殖品種，給水產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。對(duì)蝦的蛋白質(zhì)含量高，脂肪含量低，且含有多種維生素及微量元素，是優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品的代表之一，并深受人們喜愛。隨著生活水平的提升，對(duì)蝦需求量的日益增長(zhǎng)，世界對(duì)蝦市場(chǎng)依然呈現(xiàn)供不應(yīng)求的局面。因此對(duì)蝦的人工養(yǎng)殖，在最近二十年間，有了突飛猛進(jìn)的增長(zhǎng)。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織 FAO統(tǒng)計(jì)，全球?qū)ξr產(chǎn)量（包括人工養(yǎng)殖量和捕撈量）由 1970 年的 9000 噸左右，發(fā)展到 2006 年的 315 萬噸。最近幾年，全球?qū)ξr的產(chǎn)量也保持在 350 萬噸以上，具體統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見于圖 1.1 所示。隨著我國(guó)對(duì)蝦產(chǎn)量的逐年上升，在趕超泰國(guó)后，已經(jīng)成為對(duì)蝦養(yǎng)殖的第一大國(guó)。

(Tsai et al., 1999)。該病主要是由對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus，WSSV）引起(Kanchanaphum et al., 1998)。WSSV 是一種含有囊膜的 DNA 病毒，，該病毒感染對(duì)蝦后，能夠造成對(duì)蝦在短時(shí)間內(nèi)大量死亡，給對(duì)蝦養(yǎng)殖帶來致命性的災(zāi)難。雖然大量的研究嘗試著解決這一難題，但是目前仍沒有有效的方法，主要以預(yù)防為主(Liu et al., 2009; Robalino et al., 2007)。此外還有黃頭病毒（yellowhead virus，YHV）導(dǎo)致的對(duì)蝦黃頭�。╕HD）(Brown et al., 2012)，偷死病毒（covertmortality nodavirus，CMNV）引起的偷死病（CMD）(Zhang et al., 2014)，小孢蟲寄生蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）引起的肝胰腺微孢子蟲�。℉PM）(Chayaburakul et al., 2004; Tourtip et al., 2009)，林查辛格病毒（Laem Singh virus，LSNV）導(dǎo)致的斑節(jié)對(duì)蝦慢大癥（Monodon slow growth syndrome，MSGS）(Pratoomthai et al., 2008)等。總之，各種蝦類病原體的出現(xiàn)，給對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此為了有效地降低對(duì)蝦病害的爆發(fā)，減少病害所帶來的損失，需要對(duì)對(duì)蝦的免疫系統(tǒng)和抗病機(jī)理進(jìn)行系統(tǒng)的研究。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院研究生院(海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2691232