本文關鍵詞：農(nóng)桿菌介導虎杖芪合酶基因遺傳轉化棗樹增強抗性的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：壺瓶棗(Zizyphus jujuba Mill.)是中國優(yōu)質(zhì)棗品種之一,但真菌性病害已嚴重制約了壺瓶棗生產(chǎn)；白藜蘆醇作為植物次生代謝產(chǎn)物不但能提高果樹抗真菌能力,還具有具有眾多的藥理和保健功能,其中最令人矚目和具有發(fā)展前景的是其抗腫瘤、心血管保護、抗氧化功能。大量研究表明,遺傳轉化STS基因能夠增強植物的抗真菌能力,本研究的目的為芪合酶基因遺傳轉化棗樹提高棗樹的抗真菌病害能力和改善棗的果品品質(zhì)。壺瓶棗作為山西太谷的地理標識品種,經(jīng)濟價值高,產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景好。白藜蘆醇在虎杖根中含量較高,前期研究從虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)根中分離得到白藜蘆醇合成芪合酶關鍵基因PcPKS5(EU647245),具有高效催化合成白藜蘆醇功能。本研究通過組織培養(yǎng)與遺傳轉化技術,對壺瓶棗優(yōu)良單株進行組織培養(yǎng),即獲得高效莖尖和莖段誘導的叢生芽建立植物再生體系,構建虎杖芪合酶基因植物表達載體,轉化農(nóng)桿菌,將虎杖白藜蘆醇生物合成關鍵基因PcPKS5遺傳轉化壺瓶棗。結果如下：(1)優(yōu)化壺瓶棗徑段誘導得到高分化率的叢生芽遺傳轉化體系。將壺瓶棗再生體系材料剪成0.8-1.0 cm含莖尖和莖段的外植體,農(nóng)桿菌侵染菌液中浸泡15.0min,集中置于培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天,避光培養(yǎng),轉入含Cb300 mg/L, AS 60 mg/L叢生芽誘導分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-6周。將分化叢生芽轉接至含4.0mg/L Basta,5-6周檢測陽性植株,為壺瓶棗成功實現(xiàn)遺傳轉化奠定了基礎；(2)成功將狗頭棗葉片外植體材料誘導出愈傷組織,并分化得到完整植株,并建立了狗頭棗葉片再生遺傳轉化體系；(3)壺瓶棗遺傳轉化材料經(jīng)Basta篩選、GUS顯色、gDNA PCR、RT-PCR等檢測證實,成功獲得到3個陽性轉基因壺瓶棗株系,熒光實時定量檢測RNA瞬時表達得到其中株系2表達效率高于其他兩個株系。經(jīng)植物化學成分鑒定遺傳轉化植株中存在白藜蘆醇,研究結果表明轉化植株中虎杖芪合酶在壺瓶棗異源表達,目的基因表達代謝生成目標產(chǎn)物白藜蘆醇,其鮮重含量為0.45μg/g,抑菌效果相當于1ug/ul白藜蘆醇樣品(抑菌率平均為23.08%),具備抗真菌桃褐腐(Monilinia fructicola)真菌、棗假尾孢(Isariopsis imdica var. Ziziphi)、細交鏈孢菌[Alternaria alternate(Fr.)Keissler]的能力。同時相對野生型植株,朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinus)有趨避遺傳轉化植株的現(xiàn)象發(fā)生。本研究在壺瓶棗成功遺傳轉化虎杖芪合酶基因,獲得壺瓶棗遺傳轉化新材料。且PcPKS5在棗樹中異源表達,轉基因材料中能夠代謝合成白藜蘆醇,提高轉PcPKS5基因壺瓶棗抗棗樹病原真菌病能力,研究結果為發(fā)掘棗樹新的種質(zhì)資源提供技術途徑。有關壺瓶棗遺傳轉化材料是否在果實中積累,改善果品品質(zhì)仍需深入研究。
【關鍵詞】：遺傳轉化 虎杖芪合酶基因 棗樹 農(nóng)桿菌介導法 白藜蘆醇 增強抗性
【學位授予單位】：北京林業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S665.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-14
• 1. 緒論14-30
• 1.1. 棗栽培、產(chǎn)業(yè)發(fā)展及存在需要解決的問題14
• 1.2. STS基因與遺傳轉化代謝白藜蘆醇14-19
• 1.2.1. STS基因15
• 1.2.2. 白藜蘆醇是從植物體中獲取最有前景的物質(zhì)之一15-16
• 1.2.3. 白藜蘆醇在營養(yǎng)和醫(yī)藥方面的應用16
• 1.2.4. 白藜蘆醇在農(nóng)業(yè)方面對應用16
• 1.2.5. 商業(yè)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法16-19
• 1.3. 芪合酶遺傳轉化實例19-22
• 1.3.1. 芪合酶基因來源19
• 1.3.2. 農(nóng)作物過表達芪合酶基因19-21
• 1.3.3. 果樹基因工程研究現(xiàn)狀21-22
• 1.3.4. 棗樹基因工程遺傳轉化研究22
• 1.4. 立題依據(jù)與產(chǎn)業(yè)前景22-24
• 1.4.1. 立題依據(jù)22-24
• 1.4.2. 擬解決的關鍵問題24
• 1.5. 本研究的目的意義24-25
• 1.6. 技術路線25-26
• 1.7. 試驗研究方法26-30
• 1.7.1. 棗樹的高效率再生體系的研究26-27
• 1.7.2. 植物表達載體構建27
• 1.7.3. 遺傳轉化體系建立27
• 1.7.4. 遺傳轉化植株檢測27-30
• 2. 芪合酶基因植物表達載體的構建30-36
• 2.1. 材料與方法30-31
• 2.1.1. 基因及試劑30
• 2.1.2. 方法30-31
• 2.2. 結果與分析31-34
• 2.2.1. 表達載體的構建與侵染菌株制備31-33
• 2.2.2. 構建植物表達載體的驗證33-34
• 2.3. 討論34
• 2.3.1. 表達載體構建成功34
• 2.3.2. 植物表達載體的應用前景分析34
• 2.4. 本章小結34-36
• 3. 壺瓶棗遺傳轉化體系的建立36-48
• 3.1. 材料與方法36-39
• 3.1.1. 壺瓶棗與試劑36-37
• 3.1.2. 方法37-39
• 3.2. 結果與分析39-45
• 3.2.1. 壺瓶棗棗苗生長狀況結果的統(tǒng)計分析39-40
• 3.2.2. 壺瓶棗無性系生根40-41
• 3.2.3. 遺傳轉化影響因子的篩選41-43
• 3.2.4. 遺傳轉化體系的優(yōu)化43-45
• 3.2.5. Basta篩選遺傳轉化體系材料的獲得45
• 3.3. 討論45-46
• 3.3.1. 外植體材料的可行性分析45
• 3.3.2. 壺瓶棗遺傳轉化體系的建立45-46
• 3.4. 本章小結46-48
• 4. 狗頭棗遺傳轉化體系的建立48-58
• 4.1. 材料與方法48-51
• 4.1.1. 狗頭棗及試驗試劑48
• 4.1.2. 方法48-51
• 4.2. 結果與分析51-56
• 4.2.1. 狗頭棗葉片誘導愈傷組織的培養(yǎng)基篩選51-52
• 4.2.2. 狗頭棗愈傷組織的分化52-53
• 4.2.3. 狗頭棗狗頭棗誘導生根53
• 4.2.4. As對葉片愈傷組織誘導的影響53
• 4.2.5. 抗生素的篩選53-54
• 4.2.6. AgNO_3對愈傷組織分化的影響54
• 4.2.7. 無性系試管苗抗除草劑試驗54-55
• 4.2.8. 狗頭棗遺傳轉化體系優(yōu)化55-56
• 4.3. 討論56-57
• 4.3.1. 狗頭棗葉片再生體系的建立56-57
• 4.3.2. 再生遺傳轉化體系仍需深入研究57
• 4.4. 本章小結57-58
• 5. 轉基因材料測試驗證58-68
• 5.1. 材料與方法59-61
• 5.1.1. 遺傳轉化材料及試劑59
• 5.1.2. 方法59-61
• 5.2. 結果與分析61-65
• 5.2.1. 陽性植株的檢測61-63
• 5.2.2. 白藜蘆醇的提取、分離與HPLC、LCMS分析63-65
• 5.3. 討論65-66
• 5.4. 本章小結66-68
• 6. 轉基因材料的抗性試驗68-76
• 6.1. 材料與方法68-69
• 6.1.1. 遺傳轉化材料與棗病原真菌68-69
• 6.1.2. 方法69
• 6.2. 結果與分析69-73
• 6.2.1. 白藜蘆醇抑菌桃褐腐試驗69-70
• 6.2.2. 壺瓶棗遺傳轉化材料抑菌試驗70-72
• 6.2.3. 遺傳轉化材料抗螨蟲試驗72-73
• 6.3. 討論73-75
• 6.4. 本章小結75-76
• 7. 結論76-80
• 7.1. 主要結果76-77
• 7.1.1. 成功構建PcPKS5植物表達載體76
• 7.1.2. 建立和優(yōu)化棗樹再生遺傳體系76
• 7.1.3. 虎杖芪合酶基因在棗樹異源成功表達76
• 7.1.4. 轉基因遺傳棗樹材料產(chǎn)生新的抗性76-77
• 7.2. 本研究的創(chuàng)新點77
• 7.3. 棗樹轉基因的展望與環(huán)境安全的思考77-80
• 參考文獻80-94
• 附錄94-96
• 個人簡介96-98
• 導師簡介98-100
• 成果目錄100-102
• 致謝10

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