新型重組H5亞型高致病性禽流感病毒的致病性與傳播性研究

發(fā)布時間：2017-03-22 02:17

本文關鍵詞：新型重組H5亞型高致病性禽流感病毒的致病性與傳播性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：基因重配造成了人類歷史上多次流感的大流行,1957年的亞洲流感就是由于當時流行的H1N1亞型毒株從禽流感病毒中獲得了HA、NA和PB1基因；1968年的香港流感(H3N2)則是當時H2N2亞型人流感病毒從禽流感病毒中獲得HA和PB1基因。2009年甲型H1N1流感病毒則被認為是四源基因重排的結果,PB2和PA來源于禽流感病毒,PB1來源于1968香港H3N2人流感病毒,HA、NP和NS來源于早期流行于北美地區(qū)的H1N1豬流感病毒,而NA和M則由20世紀90年代初歐亞豬群中流行的H1N1病毒提供。2013年初在中國華東地區(qū)發(fā)生了H7N9亞型禽流感病毒感染人事件,到目前為止該病毒仍在不斷的感染人,并且引起了比較高的死亡率。該病毒是通過H7亞型的病毒與帶N9 NA基因的病毒,以及流行于我國家禽中的H9N2亞型禽流感病毒的基因重配產(chǎn)生的。高致病性禽流感(HPAI)H5N1最早于1996年從我國廣東地區(qū)的發(fā)病鵝群中分離到,其HA基因已經(jīng)進化出Clade0-9共計10個不同的進化分支,其中的一些分支隨著病毒的不斷進化還出現(xiàn)了二級、三級甚至是四級亞分支。H5N1亞型HPAI由于能感染少部分人并具有高致死率,給人類公共衛(wèi)生安全構成巨大的威脅。盡管目前H5N1高致病性禽流感病毒還沒有獲得在人與人之間高效傳播的能力,但是近年來開始不斷的從各種家禽里分離到許多新型重組病毒,這些病毒的HA基因都來源于Gs/GD/96-like,而其它基因卻來自其它各種亞型的流感病毒。了解這些新型重組H5亞型高致病性禽流感病毒的致病性和傳播性,對于防控流感大流行具有重要的意義。本實驗室2010年在華東地區(qū)的活禽交易市場中分離到一株新型重組H5N2禽流感病毒A/chicken/Hebei/1102/2010 (HB10)。研究發(fā)現(xiàn)它的HA來源于我國流行的Clade 7.2 H5亞型禽流感病毒而其它基因來源于H9N2禽流感病毒,且HB10的內部基因片段與H7N9流感病毒高度相似。我們推測它可能通過進一步的基因變異獲得類似于H7N9病毒直接感染人的能力。為了研究HB10跨種間傳播的潛在機制,我們將該病毒在小鼠肺內連續(xù)傳代,并對傳代過程中病毒的毒力變化進行測定。結果顯示,當將HB10病毒傳到第5代時其對小鼠的半數(shù)致死劑量(MLD50)由1070EID50下降為10485EID50,其毒力增強了100多倍；而傳到第15代時,病毒變異為高毒力毒株。隨后,我們對第15代病毒進行了克隆、純化,獲得一株對小鼠高毒力的鼠適應毒HB10-MA,并對病毒HB10-MA的生物學特性進行了研究。結果顯示,HB10-MA的MLD50為1025EID50,與HB1O相比其毒力至少高出1045倍；同時HB10-MA病毒在小鼠肺內的增殖滴度和速度均顯著高于HB10病毒,并且HB10-MA病毒的復制部位從肺臟擴展到了心、肝、脾、腎及腦組織,而HB10病毒僅能在肺臟中復制。與此同時,HB10-MA在哺乳細胞MDCK和A549上的復制能力也明顯增強。序列比對發(fā)現(xiàn),與HB10病毒相比HB10-MA在4個基因上發(fā)生了5個氨基酸位點的突變,分別為HA-S227N,PB2-Q591K, PB2-D701N, PA-V554I和NP-R351K.我們推測這些氨基酸位點的突變可能與新型重組H5N2禽流感病毒在小鼠肺內傳代過程中的毒力增強有關。為了進一步研究鼠適應毒HB10-MA對小鼠致病性增強的分子機制,我們利用反向遺傳技術分別以HB10和HB10-MA為骨架拯救了一系列的單基因互換重組病毒,并比較了它們在小鼠模型上的毒力差異。我們發(fā)現(xiàn)PB2、PA基因是鼠適應毒HB10-MA的毒力增強的重要基因,但是PB2基因起主導作用。由于HB10與HB10-MA在PB2基因上僅有2個氨基酸位點的差異,因此我們拯救了PB2基因單個位點突變的病毒,并評價了它們在小鼠中的毒力從而進一步確定影響HB10-MA和HB10對小鼠毒力差異的關鍵氨基酸位點。結果發(fā)現(xiàn)PB2的591K和701N兩個位點是導致鼠適應毒高毒力的關鍵氨基酸位點,而且它們起著協(xié)同作用。PB2上591和701兩個位點的同時突變能在很大程度上引起HB10和HB10-MA病毒毒力、復制能力以及聚合酶活性協(xié)同改變。因此,我們的結果表明PB2上591K和701N兩個位點的共同變異是使新型重組H5N2亞型禽流感病毒鼠適應毒毒力增強的關鍵。PB2的627K被認為是許多禽源和人源流感病毒對哺乳動物高致病性的關鍵氨基酸。因此,我們將PB2-E627K與Q591K和D701N以單點、雙點或三點突變的形式引入HB10骨架,研究這些位點對病毒毒力的影響。首先,我們發(fā)現(xiàn)這些位點的單點突變增強了HB10對小鼠的毒力。其次,我們發(fā)現(xiàn)與單點突變相比,PB2-D701N與PB2-Q591K或PB2-E627K雙突變明顯增強病毒對小鼠的毒力。然而,PB2-Q591K與PB2-E627K雙突變雖然增強了病毒的體外聚合酶活性,但它們顯著致弱了病毒對小鼠的毒力。因此,我們的研究再次強調PB2基因在禽流感病毒適應哺乳動物中的關鍵作用,將有助于我們深入了解新型重組H5N2流感病毒跨種間傳播和致病的分子機制。近年來又不斷的從各種家禽里分離到了與不同的NA亞型(包括N2、N5、N6、N8)重組的新型H5高致病性禽流感病毒,并且這些病毒的HA基因均屬于Clade2.3.4變異亞分支。在這些新型重組病毒中,部分基因型已經(jīng)呈現(xiàn)流行的趨勢。最近,在一些東南亞國家相繼發(fā)生了幾次新型重組H5N6禽流感疫情且在我國發(fā)生了H5N6感染人事件,與此同時H5N8也已經(jīng)相繼在至少11個國家中爆發(fā)疫情。由于流感病毒獲得結合a-2,6唾液酸受體的能力是其在人間大流行的先決條件。因此,我們首先對這些新型重組的H5亞型高致病性禽流感病毒進行了受體結合能力的測定。結果發(fā)現(xiàn)所有檢測的新型重組H5亞型病毒在結合α-2,3唾液酸受體的同時,也獲得了α-2,6唾液酸受體的結合能力。然而受體結合特性雖然被認為是流感病毒宿主范圍的主要因素,但是獲得了α-2,6唾液酸受體的結合能力的病毒并不一定能在人群間有效地傳播。因此,接下來,我們用豚鼠模型來評價了新型重組H5亞型病毒的復制能力以及潛在的傳播能力。我們發(fā)現(xiàn)所有檢測的新型重組H5亞型病毒均能在攻毒組豚鼠體內有效地復制,值得注意的是其中的一株H5N2(GS/EC/1112/11)和一株H5N5(031)病毒在豚鼠間具有有效地接觸傳播能力。我們的研究表明當前流行于各個國家的此類新型重組H5亞型病毒可能會對人類的健康存在一定的威脅。因此,加強該病毒在家禽中的流行病學監(jiān)測、病毒分離與生物學特性分析有重要意義。為了進一步確定影響新型重組H5亞型病毒受體結合性的關鍵氨基酸位點,本研究,以只有α-2,3唾液酸受體的結合能力的Clade 2.3.4病毒A/mallard/Huadong/S/2005 (HD/05)為骨架,利用反向遺傳技術,對差異氨基酸位點(共有8個氨基酸的差異)進行定點突變,并評價點突變病毒的受體結合性。研究結果發(fā)現(xiàn)影響新型重組H5亞型病毒受體結合性的關鍵氨基酸位點是HA的160位氨基酸,T160A的突變能導致HA的158糖基化位點缺失并使得病毒獲得α-2,6唾液酸受體的結合能力。接著我們對突變株HD-160A在豚鼠體內的復制能力以及豚鼠間直接接觸傳播的能力進行評價,結果發(fā)現(xiàn)HA上158糖基化位點的缺失的病毒不但能在豚鼠體內有效的復制,還能在豚鼠間進行有效地直接接觸傳播。已有研究表明HA的158位糖基化位點的缺失能導致病毒對小鼠的毒力增強。我們也發(fā)現(xiàn)HA上158糖基化位點的缺失可以導致病毒對小鼠的毒力增強,同時增強了病毒在哺乳細胞MDCK和A549上的復制能力。因此,我們的研究表明HA的158糖基化位點的缺失可以作為一個分子標記用來評價Clade 2.3.4變異亞分支H5病毒引起大流行的潛在能力。此外,HA的158位糖基化位點的缺失導致Clade 2.3.4變異亞分支H5病毒同時具備α-2,3和α-2,6受體結合性,可能對人類和家禽都能造成危害。因此,需加強此類病毒的監(jiān)測。綜上所述,我們利用高毒力的鼠適應毒,發(fā)現(xiàn)PB2基因的變異是新型重組H5N2流感病毒跨種間傳播和毒力增強的關鍵因素,且進一步確定了PB2的591K和701N兩個位點的共同變異是新型重組H5N2亞型禽流感病毒鼠適應毒毒力增強的關鍵。同時,發(fā)現(xiàn)影響新型重組H5亞型病毒受體結合性的關鍵氨基酸位點是病毒HA的158糖基化位點的缺失。我們認為HA的158糖基化位點的缺失與否可以作為一個分子標記用來評價Clade 2.3.4變異亞分支H5病毒引起大流行的潛在能力。因此,我們的研究進一步說明對H5亞型禽流感病毒加強流行病學監(jiān)測具有重要意義,是為防控流感大流行作準備的重要措施。
【關鍵詞】：新型重組 H5N2禽流感病毒 鼠適應 致病性 受體 直接接觸傳播
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：