本文關(guān)鍵詞：層粘連蛋白受體作為豬瘟病毒吸附受體的鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：病毒是結(jié)構(gòu)簡單的微生物,無完整的代謝酶系統(tǒng),需要借助宿主細(xì)胞合成自身物質(zhì)從而完成自身生命周期。病毒囊膜蛋白與宿主細(xì)胞表面成分——細(xì)胞受體的相互結(jié)合則是一切病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的起始,并決定了病毒感染的種屬范圍和組織嗜性。尤為重要的是,病毒囊膜蛋白與相應(yīng)細(xì)胞受體的結(jié)合位點(diǎn)往往成為開發(fā)抗病毒藥物的重要靶標(biāo)。因此,針對病毒受體的研究具有重要的科研和應(yīng)用價(jià)值。豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的烈性傳染病。該病對養(yǎng)豬業(yè)危害極大,在多個(gè)國家均有流行,具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。近年來,隨著對CSFV研究的不斷深入,研究者發(fā)現(xiàn)了大量與該病毒相互作用的宿主蛋白,并探討了其機(jī)理,但針對CSFV細(xì)胞受體的研究尚屬空白。迄今,僅有硫酸乙酰肝素(Heparin Sulfate,HS)被鑒定為CSFV的吸附受體。該分子亦廣泛分布于CSFV非易感細(xì)胞表面,因此,我們推測CSFV一定存在其它尚未發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞受體,并采取一系列方法篩選細(xì)胞受體。本研究中,我們利用針對大量豬源膜蛋白基因的小分子干擾RNA來篩選可能參與CSFV感染的膜蛋白。該篩選發(fā)現(xiàn)了多個(gè)CSFV潛在受體分子。其中,層粘連蛋白受體(Laminin receptor,Lam R)已被鑒定為多種病原體的細(xì)胞受體,我們選擇該蛋白進(jìn)行后續(xù)研究。激光共聚焦分析顯示,該蛋白與CSFV在細(xì)胞膜高度共定位。免疫共沉淀試驗(yàn)說明該蛋白與CSFV囊膜糖蛋白Erns存在特異性相互作用。一系列抑制試驗(yàn)顯示,抗Lam R蛋白抗體、可溶性Lam R和Laminin蛋白均可顯著抑制CSFV的復(fù)制,并且該抑制效果呈現(xiàn)劑量依賴性。我們以表達(dá)Lam R的慢病毒感染PK-15細(xì)胞,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Lam R的細(xì)胞系。CSFV在該細(xì)胞系的復(fù)制水平顯著高于對照細(xì)胞系。我們利用吸附試驗(yàn)說明Lam R蛋白在CSFV吸附階段發(fā)揮功能,Lam R過表達(dá)細(xì)胞系較對照細(xì)胞系吸附病毒粒子數(shù)顯著增多。我們進(jìn)一步探討了HS與Lam R的關(guān)系,結(jié)果顯示,Lam R蛋白和HS互相協(xié)同,幫助病毒吸附。該現(xiàn)象在SK6細(xì)胞尤為明顯。但Lam R的表達(dá)與CSFV的組織嗜性并無明顯相關(guān)性,而其被沉默后也不影響同屬黃病毒科瘟病毒屬的BVDV的復(fù)制。綜上所述,我們利用si RNA文庫對重要的豬源膜蛋白基因進(jìn)行篩選,并通過一系列抑制試驗(yàn)、吸附試驗(yàn)確定Lam R為CSFV的又一吸附受體,該分子與已知受體HS相互協(xié)同,幫助CSFV感染。
【關(guān)鍵詞】：豬瘟病毒 細(xì)胞受體 層粘連蛋白受體 硫酸乙酰肝素
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.651
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-10
• 英文縮略表10-11
• 第一章 引言11-24
• 1.1 豬瘟與豬瘟病毒11-12
• 1.1.1 豬瘟11
• 1.1.2 豬瘟病毒11-12
• 1.2 豬瘟病毒的復(fù)制和感染機(jī)制12-13
• 1.2.1 結(jié)構(gòu)蛋白在CSFV復(fù)制中的功能12
• 1.2.2 非結(jié)構(gòu)蛋白在CSFV復(fù)制中的功能12-13
• 1.3 病毒的細(xì)胞受體研究進(jìn)展13-19
• 1.3.1 細(xì)胞受體13
• 1.3.2 非蛋白類細(xì)胞受體的篩選方法13-14
• 1.3.3 蛋白類細(xì)胞受體的篩選14-19
• 1.4 豬瘟病毒及黃病毒科病毒細(xì)胞受體的研究進(jìn)展19-22
• 1.4.1 硫酸乙酰肝素19
• 1.4.2 輔膜蛋白CD4619-20
• 1.4.3 低密度脂蛋白受體20-21
• 1.4.4 II型膜聯(lián)蛋白21
• 1.4.5 豬瘟病毒配體的研究21-22
• 1.5 層粘連蛋白受體22-23
• 1.6 本研究的目的與意義23-24
• 第二章 層粘連蛋白受體作為豬瘟病毒吸附受體的鑒定24-54
• 2.1 材料和方法24-33
• 2.1.1 毒株、細(xì)胞和載體24
• 2.1.2 其它實(shí)驗(yàn)材料24
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備24-25
• 2.1.4 試劑配制25
• 2.1.5 siRNA分子的設(shè)計(jì)25-28
• 2.1.6 干擾分子的轉(zhuǎn)染和指示病毒的感染28
• 2.1.7 Fluc活性檢測28-29
• 2.1.8 病毒毒價(jià)的測定29
• 2.1.9 流式細(xì)胞術(shù)29
• 2.1.10慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定下調(diào)細(xì)胞系和上調(diào)細(xì)胞系的構(gòu)建29
• 2.1.11細(xì)胞活力檢測29-30
• 2.1.12激光共聚焦試驗(yàn)30
• 2.1.13細(xì)胞膜蛋白的提取30
• 2.1.14免疫共沉淀試驗(yàn)30
• 2.1.15阻斷試驗(yàn)30-31
• 2.1.16可溶性蛋白競爭試驗(yàn)31
• 2.1.17 Western blotting檢測31
• 2.1.18病毒吸附試驗(yàn)31
• 2.1.19熒光定量RT-PCR31
• 2.1.20受體重建試驗(yàn)31-32
• 2.1.21適宜CSFV復(fù)制的細(xì)胞系的篩選32
• 2.1.22 CSFV感染率的測定32
• 2.1.23 LamR組織豐度檢測32
• 2.1.24 LamR對BVDV復(fù)制影響的檢測32
• 2.1.25數(shù)據(jù)分析32-33
• 2.2 結(jié)果33-50
• 2.2.1 siRNA篩選結(jié)果33
• 2.2.3 LamR沉默效果驗(yàn)證33-34
• 2.2.4 沉默LamR對不同亞型CSFV復(fù)制的影響34-36
• 2.2.5 CSFV在穩(wěn)定下調(diào)細(xì)胞系中的復(fù)制36-38
• 2.2.6 LamR與CSFV共定位情況38
• 2.2.7 LamR與Erns的相互作用38-39
• 2.2.8 可溶性LamR對CSFV復(fù)制的抑制作用39-40
• 2.2.9 可溶性Laminin對CSFV復(fù)制的抑制作用40-41
• 2.2.10 LamR抗體對CSFV復(fù)制的抑制作用41
• 2.2.11 CSFV在穩(wěn)定表達(dá)LamR的CSFV易感細(xì)胞中的復(fù)制41-43
• 2.2.12 CSFV在穩(wěn)定表達(dá)LamR的CSFV非易感細(xì)胞中的復(fù)制43-44
• 2.2.13 CSFV在非易感細(xì)胞內(nèi)復(fù)制水平檢測44-46
• 2.2.14 CSFV對細(xì)胞表面LamR的吸附能力46-47
• 2.2.15 CSFV對肝素酶處理細(xì)胞的感染率47-49
• 2.2.16 LamR在豬體不同器官豐度檢測49
• 2.2.17 LamR不影響B(tài)VDV的增殖49-50
• 2.3 討論50-54
• 第三章 全文結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-65
• 致謝65-66
• 個(gè)人簡歷66

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