【摘要】：黃瓜作為世界蔬菜生產(chǎn)的重要栽培作物,因其味道清香、口感爽脆,深受人們喜愛,在市場(chǎng)消費(fèi)中占有重要地位。然而黃瓜在生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)常受到多種病害和蟲害的危害,嚴(yán)重影響產(chǎn)量或者品質(zhì),其中黃瓜霜霉病的影響最為嚴(yán)重。霜霉威(propamocarb,PM)是一種可以有效控制黃瓜霜霉病的殺菌劑,主要以噴施方式進(jìn)行防治,病害得到防治的同時(shí),也會(huì)使霜霉威在黃瓜體內(nèi)產(chǎn)生殘留。近年來(lái),隨著生活質(zhì)量的提高,人們?cè)絹?lái)越重視食品安全問(wèn)題,尤其是農(nóng)藥殘留。因此,黃瓜低農(nóng)藥殘留性的研究,不僅可以有效減少農(nóng)藥使用量,降低生產(chǎn)成本,減少對(duì)環(huán)境的污染,還能更好地防止對(duì)人體健康的危害。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在植物解毒代謝中起著重要的作用,參與多種抗逆反應(yīng)。本研究選取黃瓜低殘留品系D0351和高殘留品系D9320為研究對(duì)象,克隆了2個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,并在生物信息學(xué)分析、表達(dá)模式分析、遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證等方面展開了研究,主要結(jié)果如下:(1)基于低霜霉威殘留品系D0351霜霉威脅迫處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),得到29個(gè)差異表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,進(jìn)化分析表明這些ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因分別屬于5個(gè)ABC亞家族的成員,包括ABCB 6個(gè)、ABCC 7個(gè)、ABCG 10個(gè)、ABCF 2個(gè)、ABCI 4個(gè)。(2)利用q RT-PCR技術(shù)分析了黃瓜CsABC19、Cs PDR和Cs MRP基因經(jīng)霜霉威脅迫后的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在低殘留品系D0351和高殘留品系D9320中,受霜霉威脅迫Cs ABC19轉(zhuǎn)錄水平分別呈現(xiàn)誘導(dǎo)上調(diào)和下調(diào),CsPDR轉(zhuǎn)錄水平均呈誘導(dǎo)上調(diào),而CsMRP轉(zhuǎn)錄水平均呈誘導(dǎo)下調(diào)。霜霉威處理下不同時(shí)期不同組織表達(dá)分析表明,黃瓜Cs ABC19和Cs PDR基因在低殘留品系D0351中被誘導(dǎo)表達(dá)增加的倍數(shù)要高于高殘留品系D9320,并且其能快速響應(yīng)霜霉威信號(hào),能夠在霜霉威脅迫初期發(fā)揮重要作用。(3)不同組織的表達(dá)分析結(jié)果顯示黃瓜Cs ABC19和Cs PDR基因呈組成性表達(dá),且具有組織差異性和品種差異性,D0351的生殖器官中(果皮、果肉、雌花和雄花)表達(dá)量高于D9320,相反,營(yíng)養(yǎng)器官中(葉片、莖和根)表達(dá)量低于D9320。(4)克隆了黃瓜CsABC19和CsPDR基因,分別屬于ABCF亞家族和ABCG亞家族,多序列比對(duì)結(jié)果表明,Cs ABC19與其他植物ABC蛋白的氨基酸序列在Walker A、Walker B以及ABC標(biāo)簽基序處高度保守;CsPDR基因編碼的蛋白具有全轉(zhuǎn)運(yùn)子結(jié)構(gòu),包含2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(trans-membrane domains)和2個(gè)核苷酸結(jié)合區(qū)域(nucleotide binding domains);啟動(dòng)子序列預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn),存在調(diào)控真核基因轉(zhuǎn)錄的基本元件和一些與激素及脅迫誘導(dǎo)等相關(guān)的調(diào)控元件。同時(shí)構(gòu)建了Cs ABC19和CsPDR基因過(guò)表達(dá)載體。(5)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建的Cs ABC19基因植物過(guò)量表達(dá)載體導(dǎo)入擬南芥,獲得轉(zhuǎn)基因純合株系,進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因及野生型進(jìn)行霜霉威和糖脅迫處理,結(jié)果表明,Cs ABC19基因提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)霜霉威和糖脅迫的適應(yīng)性和耐性,并且使轉(zhuǎn)基因植株的霜霉威殘留量有所降低。(6)成功構(gòu)建Cs ABC19基因與綠色熒光蛋白(GFP)的融合表達(dá)載體,通過(guò)綠色熒光蛋白(GFP)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)分析檢測(cè),CsABC19基因在細(xì)胞核、細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。(7)研究了黃瓜649和D9320品種對(duì)Kan的敏感性。黃瓜649和D9320的Kan不定芽誘導(dǎo)選擇壓濃度分別為75mg/L和50mg/L,根誘導(dǎo)選擇壓濃度均為50mg/L。最佳侵染時(shí)間為20min,最佳共培養(yǎng)時(shí)間為3d。(8)獲得轉(zhuǎn)Cs ABC19基因黃瓜株系5株,檢測(cè)為陽(yáng)性植株。
【圖文】：

圖 1-1 不同生物體的 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Fig. 1-1ABC transporter proteins in allorganisms1.1.4.1 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一般都存在跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域（transmembrane domain，TMD）和核苷酸結(jié)合區(qū)域（nucleotide binding domain，NBD），其中每個(gè) NBD 含有 3 個(gè)高度保守的特征基序（WalkeA 盒［GXXGXGKS/T］ ［(RK) X3GX3L (hydrophobic)3］和 Walker C）ǎNBD 能夠結(jié)合并水解 ATP，而 TMD 進(jìn)一步利用水解 ATP 產(chǎn)生的能量，選擇底物完成跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)ǎABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以在不同生物體內(nèi)找到，并且它們的結(jié)構(gòu)相似程度大，NBD 保守性高，也就使得它們的作用機(jī)制也具有一定的相似性ǎ目前，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作用機(jī)理可以用一種門控模式的說(shuō)法加以解釋說(shuō)明，此種說(shuō)法也能夠被人們接受ǎ當(dāng) ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有膜外結(jié)合蛋白時(shí)，TMD 形成運(yùn)輸通道，，底物被轉(zhuǎn)運(yùn)之前，外周質(zhì)的門呈現(xiàn)開放狀態(tài)，向胞質(zhì)面的門呈現(xiàn)關(guān)閉狀態(tài)ǎ當(dāng)膜外結(jié)合蛋白與底物結(jié)合時(shí)，信號(hào)傳遞到 NBD，使 NBD 發(fā)生結(jié)合同時(shí)水解產(chǎn)生 ATP，引起 TMD構(gòu)象變化，使底物分子完成跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[41-44]ǎ1.1.4.2 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的進(jìn)化在擬南芥中，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含 13 個(gè)亞家族，并且其結(jié)構(gòu)域組織形式多樣化，其中全分子的 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含 4 個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域，以正向方式（TMD-NBD-TMD-NBD）連接的

圖 1-2 擬南芥 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白概述Fig. 1-2 Overview of the ArabidopsisABC transporters1.1.5 基因功能分析方法隨著生命科學(xué)的發(fā)展及研究領(lǐng)域的不斷開拓，生物和生命科學(xué)的研究已轉(zhuǎn)向分子水平，并且研究?jī)?nèi)容也不斷深入和推進(jìn)，進(jìn)而獲得的未知新基因也越來(lái)越多，對(duì)基因新功能的研究開展地越來(lái)越迅速，新基因的成功克隆也為基因功能研究提供了重要條件，因此對(duì)新基因功能的研究顯得日益重要，這也是后基因組時(shí)代功能基因組學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容和首要任務(wù)[77]ǎ1.1.5.1 促使基因表達(dá)基因功能研究的功能獲得可以通過(guò)將新基因直接導(dǎo)入到某一細(xì)胞或個(gè)體中，促使基因的表達(dá)，通過(guò)對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為變化加以觀察，或個(gè)體表型遺傳性狀發(fā)生的改變來(lái)判定和確定基因的功能，可以利用基因瞬時(shí)表達(dá) 過(guò)量表達(dá)和異源表達(dá)等方法ǎ基因過(guò)量表達(dá)（Gene overexpression），首先將獲得的目的基因全長(zhǎng)序列與高活性的組成型或組織特異性啟動(dòng)子融合，然后利用轉(zhuǎn)化方法，使該基因整合到植物或動(dòng)物基因組中，進(jìn)而獲得基因產(chǎn)物大量積累的個(gè)體ǎ基因超表達(dá)技術(shù)能夠控制外源基因在時(shí)間 空間或特定組織中的表達(dá)，可以對(duì)基因功能進(jìn)行系統(tǒng)性的研究ǎSu 等[78]的研究表明，AGL15 超表達(dá)可以
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S436.421.11

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2572024