【摘要】：團頭魴(Megalobrama amblycephala),俗稱武昌魚,是我國一類重要的大宗淡水養(yǎng)殖經濟魚類。最近幾年由于養(yǎng)殖密度不斷的擴大以及生態(tài)環(huán)境的惡化等原因,各類疾病頻發(fā)。在這其中,由嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)引起的細菌性敗血癥對于團頭魴養(yǎng)殖業(yè)的危害最大。到目前為止還沒有有效的預防和治療措施。MicroRNAs(miRNAs)是一類在免疫反應過程中發(fā)揮重要作用的非編碼小的單鏈RNA分子。但是到目前為止關于團頭魴感染嗜水氣單胞菌相關的miRNAs研究未見報道。為了更好的了解miRNA在團頭魴抵抗嗜水氣單胞菌感染中的重要作用,我們首先通過高通量測序技術對團頭魴肝臟組織未感染嗜水氣單胞菌(0 h)和感染后4 h、24 h的miRNA轉錄組進行了分析,鑒定篩選了與團頭魴感染嗜水氣單胞菌免疫相關的mi RNAs。隨后對篩選的免疫相關miRNAs其調控關系和功能做了進一步的分析鑒定。主要研究結果如下:1.通過高通量測序技術構建了團頭魴肝臟組織未感染嗜水氣單胞菌(0 h)和感染后4 h、24 h 3個小RNA庫。通過分析分別獲得了11,244,207條、9,212,958條和7,939,157條clean reads。通過生物信息學分析鑒定到171個保守的miRNAs和62個新的miRNAs。通過RT-PCR,我們隨機驗證了10個新的miRNAs的存在。差異表達miRNAs分析發(fā)現,分別有61個和44個miRNAs在感染后4 h和24 h呈顯著上調或者下調的表達趨勢。隨后通過熒光定量PCR檢測了隨機挑選的9個miRNAs,它們在團頭魴肝臟感染嗜水氣單胞菌后的表達模式與高通量測序結果一致。差異表達miRNAs靶基因預測和靶基因Gene Ontology(GO)、Kyoto Encylopedia of Genes and Genomes(KEGG)注釋的分析結果表明嗜水氣單胞菌能夠影響團頭魴的多種生物學通路。在預測的靶基因中共鑒定到94個免疫相關的基因。通過熒光定量PCR檢測了隨機篩選的免疫相關miRNAs在團頭魴感染嗜水氣單胞菌后肝臟中的表達模式。最后,通過雙熒光素酶報告載體實驗初步驗證了這些miRNAs與其相應靶基因的關系。由以上結果推測差異表達miRNAs可能通過調控相應的靶基因進而參與了抵抗細菌入侵的免疫反應。這些研究結果加深了我們對于miRNA在團頭魴感染嗜水氣單胞菌后免疫反應中重要作用的認識,同時也可以促進開發(fā)有效的疾病預防措施和分子標記,為團頭魴抗病育種提供理論基礎。2.差異表達miRNAs靶基因預測結果顯示轉鐵蛋白(TF)和轉鐵蛋白受體基因(TFR)是miR-375的靶基因。熒光定量PCR分析發(fā)現感染嗜水氣單胞菌后團頭魴肝臟中TF和TFR的表達顯著上調,而miR-375發(fā)生顯著下調,miR-375與靶基因呈現相反的表達趨勢。隨后通過過表達實驗和雙熒光素酶報告載體實驗驗證了miR-375通過作用于TF和TFR的3’UTR從而抑制其表達�；赥F和TFR在鐵穩(wěn)態(tài)調控中的重要作用,我們由此推測,miR-375在團頭魴鐵穩(wěn)態(tài)和抵抗細菌入侵中發(fā)揮著重要的作用。3.差異表達miRNAs靶基因預測結果顯示miR-146a、miR-29a和miR-457b-5p共同靶向作用于TRAF6基因的3’UTR。雙熒光素酶報告載體實驗驗證了miR-146a和miR-29a可以靶向作用于TRAF6基因的3’UTR。隨后在團頭魴鰭條細胞中過表達或者抑制miR-146a和miR-29a后,TRAF6相應的受到抑制或者出現上調表達,進一步證實了TRAF6是mi R-146a和mi R-29的直接靶標。另外,我們發(fā)現在細菌感染后,肝臟、脾臟和腎臟組織中miR-146a、miR-29a和TRAF6蛋白表達均有顯著變化,總體上均是先升高后下降。LPS刺激CIK細胞后,miR-146a和miR-29a均出現顯著上升的趨勢,在12 h到達最高,最后在48 h恢復至正常水平。因此推測miR-146a和miR-29a在魚體抵抗細菌感染免疫反應中發(fā)揮著重要的作用。此外,在CIK細胞中過表達miR-146a和miR-29a后,TLR/NF-κB下游免疫相關基因NF-κB p65、NF-κB p52、IL-6和TNF-α均受到抑制,其中miR-146a對IL-6沒有顯著的抑制作用。在CIK細胞中敲降miR-146a和miR-29a后,用LPS刺激后發(fā)現相應的下游基因發(fā)生顯著上調。綜上推測,miR-146a和miR-29a作為負調控因子通過靶向調控TRAF6基因,進而參與調控TLR/NF-κB信號通路,在魚體先天性免疫反應中起到重要的作用。
【圖文】：

miRNA的生成和作用（Zanetal2014）

-2 莖環(huán)引物法檢測 miRNA 表達原理圖（Chen et al 2 Schematic for stem-loop RT-PCR for miRNA（Chen et a術術（miRNA microarray）是一類快捷、靈敏度高 miRNA 及其表達模式的技術。它是高通量測序且已經廣泛的應用于探究 miRNA 在發(fā)育（Roroce 2009）和疾病發(fā)生（Latronico and Condor但是其劣勢主要是不能對 miRNA 進行絕對定Rosa and Brivanlou 2009）。術
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S943

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本文編號：2570415