【摘要】：昆蟲免疫反應(yīng)包含由IMD和Toll通路介導(dǎo)的抗菌肽的表達(dá)、酚氧化酶催化的黑化反應(yīng)以及血細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。家蠶被馴化已經(jīng)5000多年,為中國重要的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)之一。并且家蠶是首個完成全基因組測序的鱗翅目昆蟲。因此,家蠶是昆蟲學(xué)研究的重要的鱗翅目模式之一。鐵離子是一個重要的元素,為細(xì)胞代謝所必需,參與細(xì)胞和機(jī)體的多個代謝途徑和反應(yīng)。細(xì)菌侵染影響鐵離子在昆蟲體內(nèi)的含量與分布,這為理解細(xì)菌和昆蟲的相互作用提供了重要的線索。鐵蛋白(Ferritins)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tranferrins)是兩類主要的鐵結(jié)合蛋白,維持著昆蟲體內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)。鐵蛋白存在于古細(xì)菌、細(xì)菌、植物和無脊椎動物中。它具有一個空心球體結(jié)構(gòu),含有24個亞單位。轉(zhuǎn)鐵蛋白具有抗氧化和抗細(xì)菌的能力。家蠶鐵蛋白1(BmFer1)基因含有三個內(nèi)含子,在5’非翻譯區(qū)有一個鐵離子響應(yīng)原件。BmFer1重鏈結(jié)構(gòu)域(HCH)與魚、甲殼動物及其他昆蟲的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)鐵氧化酶活性區(qū)域必需的7個氨基酸殘基高度保守。進(jìn)化分析結(jié)果顯示昆蟲的HCHs聚為一支。為檢測BmFer1是否參與對抗細(xì)菌感染,我們首先用兩種細(xì)菌感染家蠶(革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureu和革蘭氏陰性菌綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa),然后檢測家蠶血淋巴中鐵離子含量以及家蠶體內(nèi)鐵蛋白的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),細(xì)菌侵染強(qiáng)烈地引起家蠶體內(nèi)鐵離子濃度的上升,BmFer1在血細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)。為了進(jìn)一步探究BmFer1的生理功能,我們在大腸桿菌中表達(dá)了BmFer1,并純化得到重組蛋白。聚丙烯凝膠電泳和免疫印跡分析確認(rèn)了重組蛋白及其純度。鐵鰲合實(shí)驗(yàn)顯示重組BmFer1具有結(jié)合鐵離子的能力,且與濃度呈正比。此外,將重組BmFer1注射到家蠶體內(nèi)能夠降低由于細(xì)菌感染引起的鐵離子濃度的升高,說明BmFer1在血淋巴中鰲合鐵離子。我們進(jìn)一步檢測了鐵離子對細(xì)菌生長的影響。結(jié)果表明,Fe2+能夠促進(jìn)細(xì)菌的生長,而且綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌對鐵離子的敏感度不同。綠膿桿菌的生長在Fe2+濃度為0到64μM的時候被促進(jìn),對更高濃度的Fe2+不敏感；而金黃色葡萄球菌的生長則在鐵離子濃度為16 μM的時候就不再被促進(jìn)。由于注射重組BmFer1可以減輕細(xì)菌的感染程度,我們發(fā)現(xiàn)在注射細(xì)菌8小時后,家蠶體內(nèi)的活細(xì)菌數(shù)目明顯少于對照組。此外,BmFer1能夠降低家蠶由于細(xì)菌感染引起的死亡率,表明BmFer1能夠起到對抗細(xì)菌侵染的作用。由此我們得出：細(xì)菌依靠鐵離子來維持生長,而BmFer1則通過限制細(xì)菌對自由鐵離子的攝取從而阻礙細(xì)菌的生長。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S881.2

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