【摘要】：小麥和水稻作為我國種植面積最廣的兩種主要糧食作物,其安全生產(chǎn)關(guān)乎國家命脈,而農(nóng)藥殘留已成為食品和環(huán)境安全兩大熱門問題的焦點(diǎn)之一。因此,研究既能提高作物自身解毒能力又能促進(jìn)種植土中農(nóng)藥降解的方法,使作物不受農(nóng)藥毒害的同時(shí)改善種植土壤環(huán)境,是保證農(nóng)作物安全生產(chǎn)、保護(hù)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的一個(gè)重要科學(xué)問題。異丙隆和阿特拉津是兩種常用的除草劑,然而大量研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境中殘留的異丙隆和阿特拉津?qū)ν寥牢⑸锖蛣?dòng)植物產(chǎn)生嚴(yán)重影響,甚至通過食物鏈威脅人類健康。目前,歐盟水框架指令已經(jīng)把異丙隆和阿特拉津列為潛在致癌物并已禁用,但許多發(fā)展中國家(包括中國)仍在使用。本論文研究了水稻對異丙隆的毒性反應(yīng)。結(jié)合化學(xué)分析檢測和高通量測序(RNA-Seq)方法研究了異丙隆在水稻中代謝降解和分子調(diào)控解毒機(jī)制。針對農(nóng)藥異丙隆的代謝可能受到植物激素的調(diào)控作用,探究了水楊酸對小麥代謝異丙隆的影響,并對有關(guān)機(jī)理進(jìn)行闡釋。同時(shí)發(fā)現(xiàn)水楊酸對種植土壤中異丙隆的加速降解作用,研究了水楊酸對根系分泌物及土壤微生物的影響。針對農(nóng)藥脅迫下作物表觀遺傳的變化以及調(diào)控基因表達(dá)機(jī)制,初步探討了阿特拉津脅迫下水稻DNA甲基化變化的情況,并分析了 DNA甲基化調(diào)控農(nóng)藥脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)及降解代謝的機(jī)理。具體內(nèi)容以下:1.為了研究農(nóng)藥殘留對作物的毒性傷害,本文選用不同濃度的異丙隆(0,2,4, 6和8 mg L-1)處理水稻幼苗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)異丙隆處理提高了水稻幼苗組織中丙二醛含量,且在2mgL-1異丙隆處理濃度下達(dá)到最高值。同時(shí),異丙隆抑制了水稻幼苗的根葉生長和其葉綠素含量,造成了水稻幼苗組織的氧化損傷,影響了水稻的正常生長。當(dāng)異丙隆處理濃度為2 mg L-1時(shí),激活了水稻幼苗體內(nèi)抗氧化酶系超氧化物歧化酶(SOD)、漆酶(Laccase)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活力,用于抵抗農(nóng)藥異丙隆帶來的氧化脅迫。2.為了研究作物應(yīng)答農(nóng)藥異丙隆脅迫的分子機(jī)理與其代謝機(jī)制,本文選擇了已知全基因組序列的優(yōu)秀模式植物水稻作為研究對象,采用高通量測序技術(shù)對水稻幼苗轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行大規(guī)模測序,并構(gòu)建了水稻莖葉和根系異丙隆處理和非處理的四個(gè)表達(dá)文庫。結(jié)果顯示,四個(gè)表達(dá)文庫Clean tags測序量達(dá)到10,879,252～14,519,285個(gè)。通過與水稻參考基因組的比對分析,四個(gè)庫中比對上已注釋的基因數(shù)為31,009～32,118個(gè)。其中,在水稻幼苗根系和莖葉中對異丙隆脅迫響應(yīng)的差異表達(dá)基因分別有11,680和11,927個(gè)。進(jìn)一步對差異表達(dá)基因進(jìn)行Gene Ontology (GO)功能注釋和Kyoto Encylopeida of Genes and Genomes (KEGG)分析發(fā)現(xiàn)多數(shù)差異表達(dá)基因與“對環(huán)境壓力的抗性”、“外源物的降解和代謝”等一些代謝通路和生物過程有關(guān)。從轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中隨機(jī)選取12個(gè)差異表達(dá)基因做熒光定量PCR驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果與測序結(jié)果一致,說明了測序結(jié)果的可靠性。進(jìn)一步篩選出與響應(yīng)異丙隆脅迫的代謝解毒相關(guān)基因并測定了幾個(gè)重要解毒酶活力,包括:糖基轉(zhuǎn)移酶(GTs)、細(xì)胞色素P450(P450)、谷胱甘-S-硫轉(zhuǎn)移酶(GST)以及甲基轉(zhuǎn)移酶(MTs)。進(jìn)一步對這些基因進(jìn)行啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測分析,意外發(fā)現(xiàn)其中大多數(shù)的啟動(dòng)子區(qū)都含有對植物激素響應(yīng)的元件,并通過共表達(dá)分析找到了5個(gè)調(diào)控降解代謝基因的轉(zhuǎn)錄因子。運(yùn)用超高效液相色譜串聯(lián)離子阱質(zhì)譜(UPLC/Q-LTQ-MS2)分析鑒定了 19個(gè)水稻植株體內(nèi)異丙隆代謝產(chǎn)物,其中有11個(gè)代謝物是第一次在植物中被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道的。根據(jù)代謝物的結(jié)構(gòu)推測了異丙隆在水稻體內(nèi)可能的代謝途徑及參與的代謝酶,并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)許多參與的代謝酶基因在異丙隆脅迫都發(fā)生了差異表達(dá)。3.為了驗(yàn)證農(nóng)藥代謝受到植物激素的調(diào)控作用,本文探究了植物激素水楊酸對作物降解代謝農(nóng)藥異丙隆的影響。以異丙隆和小麥為供試農(nóng)藥及農(nóng)作物,水楊酸為外源葉面噴施植物激素,通過測定電導(dǎo)率和植物表型研究了水楊酸處理下異丙隆對小麥脅迫的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 mg L-1水楊酸處理緩解了異丙隆對小麥的毒害。通過超高效液相色譜串聯(lián)飛行質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF-MS2)分析鑒定了 15個(gè)小麥植株體內(nèi)異丙隆代謝產(chǎn)物,其中有4個(gè)代謝物區(qū)別于水稻代謝物并在植物中被第一次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道。根據(jù)代謝物的結(jié)構(gòu)推測了異丙隆在小麥體內(nèi)可能的代謝途徑并發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)Ⅱ相代謝物(即:結(jié)合物)為糖基化產(chǎn)物。對代謝物進(jìn)行相對定量分析后發(fā)現(xiàn),與對照組相比水楊酸處理的小麥體內(nèi)異丙隆積累量明顯降低,而部分代謝產(chǎn)物豐度顯著增加,特別是糖基化產(chǎn)物。結(jié)果表明水楊酸加速了異丙隆在小麥體內(nèi)的代謝速率,特別是Ⅱ相糖基化代謝速率。外施水楊酸下異丙隆處理小麥體內(nèi)的糖基轉(zhuǎn)移酶活力顯著增高。同時(shí),選擇了 4個(gè)已有文獻(xiàn)報(bào)道的小麥糖基轉(zhuǎn)移酶基因,并測定其在水楊酸和異丙隆處理下的表達(dá)量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)量都受到異丙隆處理的誘導(dǎo)。其中一條編碼水楊酸糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(基因號(hào):CD876318)在水楊酸作用下出現(xiàn)高表達(dá)�？梢�,外源使用水楊酸刺激了水楊酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá),增加了異丙隆降解產(chǎn)物以及糖基化產(chǎn)物的豐度,加速了農(nóng)藥在小麥體內(nèi)的降解,從而緩解了異丙隆對小麥的毒害作用。4.為了探索同時(shí)發(fā)現(xiàn)的水楊酸對小麥種植土壤中異丙隆有加速降解作用的原因,本文對土壤中兩個(gè)主要影響農(nóng)藥降解的因素(植物根系分泌低分子有機(jī)酸和土壤微生物)展開研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)水楊酸的應(yīng)用顯著提高了根際土壤中酒石酸、蘋果酸和草酸3種低分子有機(jī)酸的含量。研究了外源水楊酸對小麥種植土中微生物種群數(shù)量與群落結(jié)構(gòu)的影響,測定了根際、混合和非根際土中土壤微生物有機(jī)碳、氮(SMBC/N)和磷脂脂肪酸(PLFAs)的含量。結(jié)果顯示,水楊酸處理下的小麥種植土中土壤微生物有機(jī)碳氮含量與對照組相比明顯升高,在根際土中尤為顯著。用于表征微生物總量的總磷脂脂肪酸(PLFAs)含量也受到水楊酸影響而顯著上升;一些表征土壤壓力的特征磷脂脂肪酸含量顯著下降,以及部分表征細(xì)菌(如:革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌)和真菌的特征磷脂脂肪酸含量顯著上升。結(jié)果說明,水楊酸誘導(dǎo)植物分泌的低分子有機(jī)酸,豐富了土壤中微生物的數(shù)量和種群結(jié)構(gòu),緩解了異丙隆對土壤生態(tài)的脅迫。本文還測定了過氧化氫酶(CAT)、脫氫酶(DHA)和酚類氧化酶(PO) 3種土壤降解酶活力。結(jié)果表明,異丙隆顯著抑制了脫氫酶和酚類氧化酶的活力,而水楊酸處理明顯緩解了這種抑制。通過主成分分析和相關(guān)矩陣分析得出水楊酸的應(yīng)用與土壤低分子有機(jī)酸、土壤酶、土壤微生物數(shù)量和異丙隆降解速率成正相關(guān)。通過UPLC-TOF-MS2分析鑒定了 5個(gè)異丙隆在種植土中的代謝產(chǎn)物。與對照組相比,施用水楊酸后小麥體內(nèi)有更多異丙隆降解產(chǎn)物被檢出。水楊酸作為一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)遞分子,誘導(dǎo)了小麥根系分泌低分子有機(jī)酸。同時(shí),低分子有機(jī)酸作為營養(yǎng)源,促使根系周圍微生物的大量繁殖,加強(qiáng)了“根際效應(yīng)”,從而提高了根系周圍農(nóng)藥異丙隆的降解速率。5.為了解決農(nóng)藥脅迫下表觀遺傳的變化與基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚不明確的問題,本文利用全基因組甲基化測序手段,展示了阿特拉津處理下的水稻全基因組DNA甲基化單堿基分辨率譜圖。結(jié)果顯示阿特拉津處理改變了水稻基因組中許多CG和非CG的甲基化位點(diǎn)和水平。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),阿特拉津改變了許多編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移和DNA去甲基轉(zhuǎn)移酶的基因的表達(dá)。在阿特拉津處理的水稻中,本文發(fā)現(xiàn)了基因在其上游、本體和下游區(qū)域發(fā)生高甲基化情況多于低甲基化。DNA甲基化和表達(dá)譜數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),與對照相比有674個(gè)基因在阿特拉津脅迫下甲基化水平發(fā)生改變,其轉(zhuǎn)錄水平也存在顯著差異。從中選擇出一些參與外源物代謝的基因,測定其在甲基化或去甲基化功能缺失突變體中的表達(dá)量變化。結(jié)果表明,DNA甲基化影響了基因的轉(zhuǎn)錄水平,特別是小RNA介導(dǎo)的DNA甲基化。另外,本文用DNA甲基化通用抑制劑5-azacytidine(AZA)和阿特拉津共同處理水稻幼苗,發(fā)現(xiàn)在阿特拉津脅迫下,AZA處理促進(jìn)了水稻的生長并減少了阿特拉津在其體內(nèi)的積累量。運(yùn)用UPLC/Q-TOF-MS2在水稻體內(nèi)鑒定了 8種阿特拉津降解產(chǎn)物和9種結(jié)合物。其中,有2個(gè)阿特拉津代謝產(chǎn)物在水稻中是第一次被報(bào)道。對代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量分析的結(jié)果顯示AZA處理提高了一部分代謝產(chǎn)物的相對豐度,包括:P450介導(dǎo)的降解產(chǎn)物DIA和HA,以及大多數(shù)GST介導(dǎo)的谷胱甘肽綴合物。綜上所述,阿特拉津通過誘導(dǎo)水稻基因組甲基化的改變,調(diào)控了參與代謝和解毒的一些基因的表達(dá),從而達(dá)到降解阿特拉津的目的。
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圖片說明： 低（以ｍｇ邋ｋｇ“鮮重計(jì)量），通常以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式存在，其結(jié)合態(tài)包括：糖逡逑基化、甲基化或氨基酸結(jié)合物等（Ｌｅｅ等，１９９５）。植物體中水楊酸的合成主要通過兩逡逑條途徑，分別是異分支酸合成酶途徑和苯丙氨酸解氨酶合成途徑（圖１－３）。逡逑Ｓｈｉｋｉｍｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑Ｈ逡逑Ｈ00ｃ邋－邋｜邋＿ＣＨＳ邋＾，，ＣＯＯＨ邐９°°＂邐ｆ°Ｈ逡逑Ａｒｏｇｅｎｉｃ邋ａｃｉｄ邐０邋ＣＯＯＨ逡逑0Ｈ邐ｃＬ邋—丨？逡逑ＣＯＯＨ邐ＣＯＯＨ邐ＣＯＯＨ邐｝逡逑［Ｊ邋邐＾邋Ｌ邐１邐Ｂｅｎｚｏｙｌ邋ｇｌｕｃｏｓｅ逡逑Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ邋Ｃｉｎｎａｍｉｃ邋ａｃｉｄ邐ＣＯＯＨ邐／邋Ｓａｌｉｃｙｄｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑ｉ邐ｖ邋ｙ逡逑Ｔ邐N，逡逑ＣＯＯＨ逡逑＾邐ｕ逡逑Ｏ＇Ｃｏｕｍａｒｌｃ邋ａｃｉｄ逡逑ＬＪ邋＾Ｕｇｎｉｎ逡逑Ｒａｖｏｎｏｌｄｓ逡逑ＯＨ逡逑ｐ－Ｃｏｕｍａｒｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑圖１－３水楊酸的生物合成途徑（ＭＳｔｒａｕｘ，邋２００２）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ邋ｐａｔｈｗａｙｓ邋ｆｏｒ邋ｓａｌｉｃｙｌｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．逡逑１３逡逑
文內(nèi)圖片：
圖片說明： ２００３）和根系的向地性（Ｍｅｄｖｅｄｅｖ和Ｍａｒｋｏｖａ，１９９１）以及抑制了果實(shí)成熟逡逑（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ和Ｄｗｉｖｅｄｉ，２０００）。除了游離的水楊酸外，植物體內(nèi)還存在許多結(jié)合態(tài)的水逡逑楊酸，如：甲基水楊酸（圖１－４）。近年來，研究發(fā)現(xiàn)甲基水楊酸是一個(gè)長距離信號(hào)分逡逑子，可以由感染病毒的葉片快速轉(zhuǎn)移到未感染的葉片，甚至可以達(dá)到植物根部（Ｎｉｅｄｅｒｌ逡逑等，１９９８）。最新研究發(fā)現(xiàn)，煙草中的甲基水楊酸是一個(gè)調(diào)控植物系統(tǒng)獲得抗性的遠(yuǎn)距逡逑離關(guān)鍵信號(hào)分子（Ｐａｒｋ等，２００９）。逡逑Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ邐｜邋Ｓｈｉｋｉｍｉｏ邋ａｃｉｄ邋Ｐａｔｈｗａｙ逡逑Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ邐氐邐Ｔ逡逑Ｏｆ邋ＳＡ邋Ｊ邐Ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ邋￣￣？邋－－？邋Ｐｈｅ逡逑｜邐Ｉｓｏ－ｃｉｒｉｓｍａｔｅ邋Ｔｒａ＾ｉｍｉａ＾ｉｄ逡逑＇ｆ邐Ｂｅｎｚｏｉｃ邋ａｃｉｄ邐ｏ－ｃｏｕｍａｒｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑｜邐Ｉ逡逑ｎ邐ＳＡ邐ＳＡ邐ＳＡ逡逑．邐１邐Ｊ邐１邐
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S481


本文編號(hào)：2515836