【摘要】：自交不親和性廣泛存在于顯花植物中,是植物長期進化出的一種為防止近交從而保持多樣性的生殖隔離機制。蘋果等薔薇科植物屬于S-RNase介導的配子體自交不親和類型。目前研究認為,花柱分泌的S-RNase通過MdABCF蛋白幫助非特異進入花粉管中,非自我S-RNase被花粉SFB/SLF識別并標記泛素,進而被26S蛋白酶體降解；自我S-RNase作為“細胞毒素”抑制花粉管生長,而至今S-RNase發(fā)揮“細胞毒性”的機制尚存在爭議,其具體分子機制尚未得到闡明。本研究以蘋果‘國光’為試材,構(gòu)建了花粉cDNA文庫,以S2-RNase的成熟多肽區(qū)為誘餌利用酵母雙雜交篩庫的方法篩選得到一個與之互作的可溶性無機焦磷酸酶蛋白,并對該蛋白參與蘋果自交不親和的作用機制進行了研究,具體結(jié)果如下：1.以S2-RNase成熟區(qū)域為誘餌篩選蘋果‘國光’(S1S2)花粉酵母cDNA文庫,獲得了2個序列完全相同、長度為484 bp的片段(A14和A24,以下由A14代表),克隆全長后發(fā)現(xiàn)該基因CDS全長為654 bp,編碼217個氨基酸。酵母雙雜交、pull-down及玉米原生質(zhì)體雙分子熒光互補實驗證明A14與Si-, S2-, S3-, S9-RNase均存在物理互作關(guān)系。2.將A14氨基酸全長序列置于NCBI比對,發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白屬于家族Ⅰ類可溶性無機焦磷酸酶。利用A14重組蛋白酶活性鑒定發(fā)現(xiàn)A14蛋白可在鎂離子存在下可水解PPi,鈣離子和EDTA可競爭性抑制其活性,因此命名該基因為MdPPa。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)MdPPa在花粉和花粉管中表達量最高�；驑屗矔r轉(zhuǎn)化蘋果花粉管結(jié)果顯示該基因定位于花粉管胞質(zhì)中,與玉米的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化結(jié)果一致。以上結(jié)果表明,MdPPa主要在花粉管胞質(zhì)中行使水解PPi的功能。3.花粉免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)S-RNase和MdPPa在花粉管胞質(zhì)中存在共定位。離體蛋白免疫沉淀實驗證明自我S-RNase能夠在花粉管胞質(zhì)中結(jié)合MdPPao分別使用15 μg /mL的自我(SPI)或異我(CPI) S-RNase處理花粉后檢測發(fā)現(xiàn), SPI處理下花粉管內(nèi)源無機焦磷酸酶活性顯著低于CPI處理,而PPi的含量卻顯著高于CPI處理。將重組的S1-, S2-, S3-, S9-RNase分別與MdPPa蛋白孵育檢測發(fā)現(xiàn),隨S-RNase濃度升高MdPPa活性不斷降低,表明S-RNase可以直接抑制MdPPa活性。此外,自花授粉花柱花粉管內(nèi)源無機焦磷酸酶活性顯著低于異花授粉處理,而PPi含量卻顯著高于異花授粉處理。將MdPPa分段后分別與S-RNase進行互作分析,結(jié)果顯示MdPPa的兩個可變區(qū)與S-RNase存在相互作用。制作該酶促反應米氏方程,分析雙倒數(shù)曲線后顯示,S-RNase作為非競爭抑制劑抑制MdPPa水解PPi的活性。以上結(jié)果表明,蘋果自我的S-RNase可進入花粉管中結(jié)合并抑制MdPPa,造成花粉管內(nèi)源無機焦磷酸酶活降低,PPi含量升高。4.利用反義寡核苷酸as-ODN轉(zhuǎn)染下調(diào)MdPPa表達后發(fā)現(xiàn),as-ODN處理的花粉管生長受到明顯的抑制,花粉管內(nèi)源無機焦磷酸酶活性顯著降低,PPi含量顯著增加,說明MdPPa對花粉管生長必不可少。針對花粉管中含有的tRNAAla和tRNAGly設計合成了地高辛標記的互補探針,檢測了不同處理下花粉管內(nèi)tRNAAla和tRNAGly氨酰化的情況,結(jié)果顯示,SPI和as-ODN處理下花粉內(nèi)均能明顯檢測到未氨�；膖RNAAla和tRNAGly,證明SPI處理和as-ODN沉默MdPPa所引起的PPi積累都能造成花粉管內(nèi)tRNA氨�；^程受阻,導致蛋白不能正常合成,最終抑制花粉管生長。授粉實驗和后代S基因型分析發(fā)現(xiàn),蘋果‘CAU-1’自交親和性由花粉側(cè)的非S因子突變造成,qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)MdPPa在‘CAU-1’和‘富士’中表達量無顯著差異,推測其自交親和性可能由其他花粉非S因子變異造成。
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【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S661.1

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2 張e，

本文編號：2441774