【摘要】：本論文旨在研究植物乳桿菌(LP)對感染產腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)K88的腸上皮細胞(IPEC-J2)屏障功能、轉運載體表達及免疫反應的影響。試驗分成3個部分:試驗一:1)選取不同濃度ETEC K88(MOI=10、25、50、75和100)攻毒IPEC-J2細胞不同時間(1、2、3和4 h),通過測定細胞存活率、IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表達,確定ETEC-K88的最佳攻毒濃度和時間,建立ETEC K88-IPEC-J2互作模型;2)選取不同濃度的LP(MOI=10、25、50、75和100)預處理IPEC-J2細胞不同時間(3、6和9 h)并攻毒,通過測定細胞存活率、IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表達,確定LP的最佳處理濃度和時間,建立LP-IPEC-J2互作模型;3)通過測定細胞培養(yǎng)上清中IL-8及TNF-α的含量,確定LP-IPEC-J2-ETEC K88互作模型。結果表明:1)與對照組相比,ETEC K88(MOI=50)攻毒IPEC-J2細胞3 h后,細胞中促炎性因子IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表達顯著上調(P0.05);因此,確定ETEC K88與IPEC-J2互作的最佳模型為MOI=50,培養(yǎng)時間3 h;2)與ETEC K88對照組相比,LP(MOI=75)預處理IPEC-J2細胞6 h后,細胞中促炎性因子IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表達顯著下調(P0.05);因此,確定LP與IPEC-J2互作的最佳模型為MOI=75,培養(yǎng)時間為6 h;3)與對照組相比,ETEC K88(MOI=50)攻毒IPEC-J2細胞3 h后,細胞培養(yǎng)上清中IL-8及TNF-α的含量顯著升高(P0.05),而與ETEC K88組相比,LP預處理后,細胞培養(yǎng)上清中IL-8及TNF-α的含量顯著降低(P0.05);綜上,我們確定ETEC-IPEC-J2-LP互作模型為:LP(MOI=75,約為1×108 CFU)預處理IPEC-J2細胞6 h后,再進行ETEC K88(MOI=50,約為6.5×107 CFU)攻毒IPEC-J2細胞3 h。試驗二:將IPEC-J2細胞接種于與Transwell 6孔板,細胞分化后(約為1.3×106個/孔),在試驗一確定的互作模型條件下,對細胞進行LP預處理和ETEC K88攻毒,之后收集細胞并保存待測定。試驗中,未做任何處理的細胞定為對照組,單獨做LP預處理的細胞定為LP組,單獨做ETEC K88攻毒的細胞定為K88組,LP預處理后進行攻毒的細胞定為LP+K88組,每組共6個重復(孔)。結果表明:1)與對照組相比,eteck88攻毒后,ipec-j2細胞teer值顯著下降(p0.05);細胞中緊密連接claduin-1、occludin、zo-1的mrna表達(p0.05)及claudin-1及occludin的蛋白表達顯著下降(p0.05);與k88組相比,lp預處理后能夠顯著抑制eteck88誘導的細胞teer值的下降(p0.05)、抑制eteck88誘導的細胞中claudin-1、occludin、zo-1的mrna表達(p0.05)及occludin蛋白表達的下降(p0.05);激光共聚焦的結果與上述結果一致,表明eteck88能夠破壞緊密連接claudin-1及occludin的表達,而lp預處理可以緩解eteck88對ipec-j2細胞緊密連接的破壞。2)與對照組相比,eteck88攻毒后,ipec-j2細胞中葡萄糖轉運載體sglt1、氨基酸轉運載體y+lat1、cat1和asct2的mrna表達均顯著下調(p0.05)、氯離子轉運載體cftr及nkcc1的mrna表達均顯著上調(p0.05);與k88組相比,lp預處理后能顯著抑制ipec-j2細胞中上述葡萄糖及氨基酸轉運載體的mrna表達的下調(p0.05)、抑制細胞中上述氯離子轉運載體mrna表達的上調(p0.05);無論是lp預處理還是k88攻毒均對細胞中葡萄糖轉運載體glut2、sglt3及氨基酸轉運載體cat2、b0,+at的mrna表達無顯著影響(p0.05)。3)與對照組相比,eteck88攻毒后,ipec-j2細胞中促炎性細胞因子il-1β、il-6、il-8及tnf-α的mrna表達顯著上調(p0.05),而抗炎性細胞因子tgfβ及ppar-γ的mrna表達顯著下調(p0.05);ipec-j2細胞中tlr1、tlr2、tlr6、tlr9的mrna表達及tlr2的蛋白表達顯著下調(p0.05),而tlr5和tlr7的mrna表達顯著上調(p0.05);細胞中tlr負調控因子sigirr、bcl3和mkp-1的mrna表達顯著下調(p0.05)。與k88組相比,lp預處理后,能夠抑制促炎性細胞因子il-1β、il-8及tnf-α的mrna表達的上調(p0.05),抑制抗炎性細胞因子tgfβ及ppar-γ的mrna表達的下調(p0.05),抑制eteck88誘導的tlr4、tlr5和tlr7的mrna表達的升高及tlr2mrna和蛋白表達的降低(p0.05),抑制eteck88誘導的sigirr、bcl3和mkp-1的mrna表達的下調(p0.05)。此外,lp單獨預處理細胞后,能夠顯著上調細胞中ppar-γ、tlr6及bcl3的mrna表達(p0.05)。無論是lp預處理還是k88攻毒處理細胞后,細胞中tlr3、tollip、a20及irak-m的mrna表達均無顯著變化(p0.05)。試驗三:將ipec-j2細胞接種于與transwell6孔板,細胞分化后(約為1.3×106個/孔),將lp(1×108cfu/well)與細胞于37°c、5%co2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)6h后,去除培養(yǎng)上清并用PBS清洗細胞。之后用ETEC K88(MOI=50,約為6.5×107CFU)攻毒細胞。在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0、12、25和50 min后,去除培養(yǎng)上清,PBS清洗細胞。之后收集細胞并測定P38、p-P38及IκBα的蛋白表達。試驗中單獨做ETEC K88攻毒的細胞定為K88組,LP預處理后進行攻毒的細胞定為LP+K88組,每組共6個重復(孔)。結果表明:與K88組相比,K88攻毒12、25及50 min后,LP預處理的細胞中IκBα的蛋白表達顯著增加(P0.05);K88攻毒25 min和50 min后,LP預處理的細胞中p-P38的蛋白表達顯著降低(P0.05),即表明LP可以一定程度上抑制ETEC K88誘導的NF-κB和MAPK信號通路。綜上所述,LP預處理能夠緩解ETEC K88誘導的促炎性因子的表達上調及抑炎性因子表達的下調,進而通過維持腸上皮細胞緊密連接mRNA及蛋白表達、維持腸道氨基酸轉運載體、葡萄糖轉運載體及下調氯離子轉運載體mRNA表達,發(fā)揮保護腸上皮細胞屏障功能及營養(yǎng)物質轉運功能的作用。LP這種保護作用的發(fā)揮可能是通過調節(jié)TLRs、NF-κB和MAPK信號通路來實現(xiàn)的。
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【學位授予單位】：華南農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28

【參考文獻】

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本文編號：2425723