【摘要】：水稻是我國(guó)重要的糧食作物之一,種植面積約占糧食播種總面積的30%,產(chǎn)量接近糧食總產(chǎn)量的44%。稻米品質(zhì)好,價(jià)值高,是我國(guó)主要的商品糧食,亦是發(fā)酵工業(yè)的重要原料。水稻病害是限制水稻進(jìn)一步提高產(chǎn)量和品質(zhì)的主要瓶頸之一。水稻條紋葉枯病(Rice stirp disease)和水稻黑條矮縮病(Rice black-streaked dwarf disease)是在水稻生產(chǎn)中普遍發(fā)生的、危害嚴(yán)重的病毒病害。發(fā)病嚴(yán)重時(shí),感病植株死亡,最終導(dǎo)致水稻產(chǎn)量明顯降低,甚至絕產(chǎn);即使存活到成熟,也表現(xiàn)為生長(zhǎng)嚴(yán)重受阻,對(duì)水稻生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失;并且兩種病毒病均是由灰飛虱持久性傳播的,在田間,這兩種病害可以同時(shí)發(fā)生,加重發(fā)病癥狀,對(duì)水稻生產(chǎn)造成更加嚴(yán)重的危害。RNA沉默(RNA silencing)是一種廣泛存在于植物、動(dòng)物、線蟲(chóng)和真菌等真核生物中,由雙鏈RNA(double strand RNA,dsRNA)引發(fā)的,通過(guò)序列特異性的相互作用來(lái)抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象,被認(rèn)為是真核生物阻止病毒、轉(zhuǎn)座子等外來(lái)核酸的入侵,維持生物基因組穩(wěn)定性的重要防御機(jī)制。其中,小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA)是沉默RNA的最主要組成部分。利用RNA干擾技術(shù)培育抗病毒的轉(zhuǎn)基因植物是目前常用的一種抗病毒基因工程策略,通常稱為RNA介導(dǎo)的病毒抗性(RNA-mediated virus resistance,RMVR)。其中,利用人工合成microRNA(artificial miRNA,amiRNA)的RNA介導(dǎo)病毒抗性策略培育抗病毒轉(zhuǎn)基因植物取得了很大進(jìn)展,具有抗性表型近乎免疫、抗性持久、生物安全性高等特點(diǎn),被認(rèn)為是一種具有較大應(yīng)用價(jià)值的植物抗病毒基因工程策略。此外,隨著對(duì)RNA介導(dǎo)的病毒抗性的不斷研究,利用RNAi策略防治病毒病已經(jīng)不止局限于培育獲得高病毒抗性的轉(zhuǎn)基因植物。目前,有研究表明,給傳毒昆蟲(chóng)介體飼喂dsRNA,可以使昆蟲(chóng)介體失去傳毒能力。這種防控病毒病的方法主要是切斷植物病毒的傳播途徑,不需要產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物就可以達(dá)到防治病毒的目的,更加具有生物安全性。本研究以水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)和水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)為實(shí)驗(yàn)材料,利用嵌合人工miRNA策略,培育獲得了具有較高抗病水平且能夠穩(wěn)定遺傳的雙抗RSV和RBSDV轉(zhuǎn)基因水稻新材料;以灰飛虱和RSV為實(shí)驗(yàn)材料,利用RNA沉默技術(shù),對(duì)可能參與昆蟲(chóng)介體傳播病毒的相關(guān)蛋白進(jìn)行了功能驗(yàn)證,在此基礎(chǔ)上,利用RNAi對(duì)昆蟲(chóng)體內(nèi)的傳毒相關(guān)蛋白進(jìn)行基因沉默,阻斷昆蟲(chóng)對(duì)病毒的傳播,減輕病毒對(duì)作物的危害。雙抗病毒轉(zhuǎn)基因水稻新材料的獲得,為我們進(jìn)一步將現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合培育抗病毒水稻新品種奠定了基礎(chǔ);介體傳毒相關(guān)蛋白的鑒定,為我們進(jìn)一步高效地利用rna沉默技術(shù)控制病毒病的危害提供重要依據(jù)。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下:(1)基于amirna策略培育雙抗rsv和rbsdv轉(zhuǎn)基因水稻新材料基于amirna抗病毒策略,選取水稻內(nèi)源的osa-mir528作為前體,利用wmd網(wǎng)站設(shè)計(jì)靶向于rsv及rbsdv的cp基因及其3′-utr區(qū)上的有效amirna;然后選擇了分別靶向于rsv和rbsdv的cp基因中間片段、3′端、3′-utr區(qū)域的3個(gè)amirna(分別命名為amir-rsvm,amir-rsv3,amir-rsvu和amir-rbsdvm,amir-rbsdv3,amir-rbsdvu)。利用重疊pcr(overlappcr)將其替換掉osa-mir528自身的mirna有效片段;然后嵌合連入改造好的pcambia1300表達(dá)載體,獲得了能同時(shí)靶向于rsv和rbsdv的3個(gè)amirna前體二聚體植物表達(dá)載體(pamir-m,pamir-3和pamir-u)。將構(gòu)建好的3個(gè)植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌eha105,瞬時(shí)侵染本生煙驗(yàn)證其有效性,3d后amirna的northern分析結(jié)果表明,構(gòu)建好的amirna植物表達(dá)載體在侵染的本生煙體內(nèi)能有效地表達(dá),產(chǎn)生成熟的amirna,并下調(diào)靶基因的表達(dá)。5′-rlm-race實(shí)驗(yàn)表明,amirna能精確介導(dǎo)靶基因序列的剪切。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化臨稻10愈傷組織,經(jīng)除草劑ppt篩選和pcr檢測(cè),分別獲得含有pamir-m,pamir-3和pamir-u的t0代轉(zhuǎn)基因植株為35株、37株、48株;轉(zhuǎn)基因植株內(nèi),各類改造后的pre-amirna均能被識(shí)別,并表達(dá)產(chǎn)生成熟的amirna。t0代轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過(guò)連續(xù)自交,結(jié)合除草劑抗性檢測(cè)和pcr鑒定,獲得t2代植株。t2代轉(zhuǎn)基因植株病毒抗性鑒定結(jié)果顯示,各轉(zhuǎn)基因株系都表現(xiàn)出了對(duì)rsv和rbsdv的不同程度的抗性,包含pamir-m,pamir-3和pamir-u的轉(zhuǎn)基因株系對(duì)rsv的抗病率分別為29.52%,44.14%和54.17%;對(duì)rbsdv的抗病率分別為26.66%,36.04%和45.83%。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行southern和northern雜交分析,結(jié)果表明,外源基因以不同的拷貝數(shù)整合到了水稻基因組中。在轉(zhuǎn)基因植株中靶病毒rna的下調(diào)是由初級(jí)的amirna介導(dǎo)所誘發(fā)的,并且沉默可以通過(guò)sirna途徑向雙邊延長(zhǎng),初級(jí)的amirna和次級(jí)的sirna共同介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)病毒的抗性。遺傳穩(wěn)定性分析表明轉(zhuǎn)基因和其介導(dǎo)的病毒抗性能在轉(zhuǎn)基因植株中穩(wěn)定遺傳。(2)介體傳毒相關(guān)蛋白的鑒定及干擾基因的表達(dá)對(duì)介體傳毒的影響以已報(bào)道的灰飛虱體內(nèi)與RSV互作的蛋白基因NCuP作為候選基因,設(shè)計(jì)引物,利用RT-PCR克隆得到目的基因。利用qRT-PCR技術(shù),研究灰飛虱NCuP在介體的不同發(fā)育階段的表達(dá)特性,發(fā)現(xiàn)其在灰飛虱的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中均有表達(dá),但不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)是存在差異的,1齡若蟲(chóng)的NCuP表達(dá)量最高,隨著昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)其表達(dá)量逐漸降低。qRT-PCR檢測(cè)RSV的侵染對(duì)不同齡期灰飛虱NCuP表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,帶毒灰飛虱體內(nèi)的NCuP的表達(dá)水平明顯高于無(wú)毒灰飛虱體內(nèi)的NCuP的表達(dá)水平,初步表明NCuP可能參與了RSV在介體內(nèi)的繁殖傳播。體外合成NCuP的dsRNA,飼喂帶RSV的灰飛虱,利用qRT-PCR檢測(cè)靶基因及病毒基因在昆蟲(chóng)體內(nèi)的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,飼喂dsNCuP的灰飛虱體內(nèi)NCuP的表達(dá)水平和RSV的積累水平均有顯著降低,推測(cè)NCuP可能參與了RSV在介體內(nèi)的繁殖。對(duì)飼喂dsNCuP的灰飛虱進(jìn)行獲毒率和傳毒率的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),對(duì)照組的獲毒率和傳毒率分別為41.44%和68.33%,而飼喂dsNCuP的灰飛虱的獲毒率和傳毒率分別為28.89%和23.89%。表明,干擾灰飛虱體內(nèi)的NCuP的表達(dá)可以顯著降低灰飛虱的獲毒率和傳毒率。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S435.11

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本文編號(hào)：2408877